3.3 ML對PEDV感染3D4/21細胞基因相對表達量的影響
PEDV主要編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為PEDV-S、PEDV-M、PEDV-N。本試驗中，細胞培養(yǎng)液中全時添加ML使PEDV-S、PEDV-M、PEDV-N基因的相對表達量顯著下調(diào)（P<0.05），表明全時添加ML可以抑制病毒的復制。然而感染后添加ML卻促進了病毒的復制，該結(jié)果說明病毒感染前添加ML可能會影響病毒的吸附和入侵，進而影響病毒的復制水平。
IL-6是一種細胞因子，其水平的變化可反映宿主炎癥程度。有研究表明，當機體受到損傷后會產(chǎn)生炎性反應，使IL-6水平提高，受到治療后IL-6水平明顯下降，從而抑制炎性反應。IL-8是一類可溶性蛋白質(zhì)，其生物功能主要涉及炎癥反應的調(diào)節(jié)。當受到外界刺激（細菌、病毒、真菌等生物因素或者氧化應激和非生物因子）時，將會激活相關(guān)通路，從而調(diào)控IL-8 mRNA的表達，參與組織損傷。IFN-β是I型干擾素的一種，其在宿主防御病毒感染和癌癥免疫檢測中都起著至關(guān)重要的作用。有研究表明，在坦布蘇病毒感染時添加外源性的IFN-β，發(fā)現(xiàn)IFN-β能抑制坦布蘇病毒的增殖。病毒入侵機體后通過與模式識別樣受體（PRRs）結(jié)合，激活下游信號通路，促進IFN-β的釋放。干擾素可以進一步調(diào)控下游信號分子，促使抗病毒基因，如MXI和ISG15的表達，從而起到抗病毒的效果。MX1蛋白能夠通過GTP酶活性水解病毒核外殼。而ISG15參與了干擾素刺激因子的修飾過程，它有兩個主要功能：一種是泛素樣功能，能夠結(jié)合和調(diào)節(jié)靶蛋白；另一種是自由形式功能，可以在細胞內(nèi)分泌或作用，主要與細胞因子的產(chǎn)生和免疫細胞的激活有關(guān)。IFITM是干擾素的負調(diào)控因子，研究表明，它通過抑制病毒包膜與宿主細胞膜的融合，從而抑制病毒的入侵，也能通過促進轉(zhuǎn)錄因子IRF3自噬性降解，負調(diào)控RLRS介導的I型干擾素產(chǎn)生的信號通路，而IFIT則通過抑制病毒的轉(zhuǎn)錄與復制，從而阻斷病毒繁殖。
本試驗中，在PEDV感染3D4/21細胞24 h時，IL-6、IL-8和IFN-β基因的相對表達量顯著上調(diào)，說明此時病毒感染已經(jīng)引起宿主的先天免疫反應，同時，抗病毒蛋白（如MX1、ISG15、IFIT1、IFITM1和IFITM3）基因的相對表達量顯著上調(diào)，這可能是PEDV頡頏宿主的固有免疫結(jié)果。而在PEDV感染3D4/21細胞12 h時，相關(guān)的干擾素抗病毒蛋白（MX1、ISG15、IFIT1和IFITM1等）的基因轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著性變化，可能是此時PEDV已經(jīng)建立復雜的免疫逃逸機制，以利于其在宿主細胞生存復制。這一觀點在MLRSV感染豬肺泡巨噬細胞模型上也得到了證實。這也可能是PEDV在感染3D4/21細胞12 h達到最高復制水平的原因。根據(jù)病毒的生長曲線，可以看出12 h是病毒基因表達水平最高的時間點，但此時的細胞形態(tài)并沒有像Wang等試驗中的IPEC細胞出現(xiàn)明顯病變，這可能是因為3D4/21是巨噬細胞的一種，其固有免疫反應比腸上皮細胞強，也說明了先天免疫系統(tǒng)介導的反應是宿主抵抗疾病的一個重要因素，隨著感染時間的延長，機體的天然免疫水平也逐漸增強。PEDV感染24 h使IFN-β基因及抗病毒基因MX1、ISG15、IFIT1、IFITM1和IFITM3的相對表達量顯著上調(diào)，然而ML處理24 h后，這些基因的相對表達量均顯著下調(diào)，這表明ML加快了3D4/21細胞免疫狀態(tài)的恢復，從而使天然免疫基因的相對表達量恢復或趨近于control組水平。
MMP13是一種致力于軟骨降解的蛋白酶，其在腫瘤細胞的惡化、侵襲等生物學行為方面起著重要作用。本試驗中，PEDV感染12 h后使3D4/21細胞MMP13基因的相對表達量顯著上調(diào)；添加ML后，3D4/21細胞MMP13基因的相對表達量顯著下調(diào)，說明ML可緩解PEDV感染帶來的損害，提高機體修復損傷的潛力。KCNJ13是一種鉀離子內(nèi)向整流蛋白，會通過協(xié)助擴散的方式運輸葡萄糖、氨基酸等離子。
在本試驗中，PEDV感染后添加ML處理12 h，3D4/21細胞KCNJ13基因的相對表達量顯著下調(diào)，說明ML可以改善腹瀉造成的離子通道損傷，使腸道離子平衡。
ML預處理細胞3 h后再進行病毒感染，可以顯著降低PEDV基因mRNA水平，說明病毒在3D4/21細胞中的表達受到抑制。ML屬于一種中鏈脂肪酸，前期已有大量的關(guān)于ML抗病毒效果的報道，蔣增良研究發(fā)現(xiàn)，0~150 mg/kg的ML可誘導C57/BL6小鼠（4周齡）系統(tǒng)內(nèi)低度炎癥，使得促炎因子TNF?α、IL-6、IL-1β含量顯著升高，抗炎因子白細胞介素-10（IL-10）含量顯著降低，進一步說明ML具有抗病毒和緩解炎癥反應的作用。本試驗中，ML對PEDV病毒感染引起的基因相對表達變化有顯著性的回調(diào)作用，說明本試驗條件下，ML發(fā)揮了一定的抗病毒和抗炎的作用，但具體作用機理還有待進一步研究。
4結(jié)論
綜上所述，在本試驗條件下3D4/21細胞培養(yǎng)液中ML的適宜添加濃度為10μmol/L；PEDV可以在3D4/21細胞中復制增殖，其中在病毒感染細胞的12 h時病毒基因的相對表達水平最高；PEDV感染24 h可以促進3D4/21細胞炎性因子和免疫因子的表達，全時添加ML可在一定程度上抑制病毒增殖，并且有助于機體免疫狀態(tài)的恢復。
十二酸單甘油酯對PEDV感染3D4/21巨噬細胞活性、基因表達的影響（一）
十二酸單甘油酯對PEDV感染3D4/21巨噬細胞活性、基因表達的影響（二）
十二酸單甘油酯對PEDV感染3D4/21巨噬細胞活性、基因表達的影響（三）
十二酸單甘油酯對PEDV感染3D4/21巨噬細胞活性、基因表達的影響（四）
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