1材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1細胞、病毒及營養(yǎng)素
豬流行性腹瀉病毒（PEDV，YN株），由華中農(nóng)業(yè)大學微生物重點實驗室饋贈；3D4/21細胞，由華中農(nóng)業(yè)大學微生物重點實驗室饋贈；ML，購自國藥集團化學試劑有限公司。
1.1.2主要試劑
主要試劑見表1。
1.1.3主要儀器
主要儀器見表2。
1.2方法
1.2.1試劑的配制
細胞完全培養(yǎng)液：在RPIM 1640培養(yǎng)液中添加1%青鏈霉素混合液(penicillin-streptomycin solution，PSF)、10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、1%非必需氨基酸（終濃度1 mol/L）和1%丙酮酸鈉（終濃度1 mmol/L）。
表2主要儀器
DMEM定制培養(yǎng)液：用DMEM粉末配制，添加血清和PSF，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH為7.2~7.4。主要成分見表3。
1.2.2 ML對3D4/21細胞活性的影響
①細胞處理。將細胞濃度調(diào)為1.2×104個/mL（此時用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液），調(diào)好的細胞懸液用排槍加到96孔板，每孔0.1 mL，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中。等到96孔板的細胞長至20%左右時，吸出原有的培養(yǎng)基，用PBS洗2遍細胞后，換成含不同濃度的ML（0、0.5、1、10、20、50μmol/L）的培養(yǎng)液（不同濃度的ML培養(yǎng)液用2%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液配制），每個濃度水平10個重復，每個重復一個孔。放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每天換液，等某組處理的細胞長滿單層后，吸出培養(yǎng)基，PBS洗2遍后，再每孔加0.1 mL配制好的含10%CCK-8的定制培養(yǎng)基，并設(shè)置只含10%CCK-8 0.1 mL的無細胞組作為陰性對照組。加入試劑后再培養(yǎng)2 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。
②計算細胞活性。
細胞活性（%）=（試驗組OD值-陰性對照組OD值）/（空白對照組OD值-陰性對照組OD值）×100試驗數(shù)據(jù)用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件中的one-wayANOVA和Duncan’s多重比較，以P<0.05為差異顯著性標準。
1.2.3 PEDV在3D4/21細胞中的生長曲線
①細胞培養(yǎng)液。基礎(chǔ)RPMI 1640培養(yǎng)液再補加1%PSF、1%非必需氨基酸（終濃度1 mmol/L）和1%丙酮酸鈉（終濃度1 mmol/L）。
②細胞處理。將細胞培養(yǎng)液的濃度調(diào)整為2.2×105個/mL，鋪6板24孔板，每孔2 mL。設(shè)置空白組和PEDV組，空白組加1 mL的培養(yǎng)基，PEDV組細胞加1 mL病毒稀釋液（即病毒原液按20倍稀釋，原液104.5 TCID50），每組設(shè)4個重復；病毒吸附1 h后棄去液體，再添加2 mL培養(yǎng)液，從放回培養(yǎng)箱起開始計時，在0、6、12、24、36、48 h每個時間點拿出一板，放在-80℃冰箱反復凍融3次（使得細胞中的病毒全部裂解到上清液中），取上清液待測。
③病毒基因相對表達量的測定方法。用TRIzol法提取細胞上清液的總RNA，在保證樣品質(zhì)量合格的情況下，先反轉(zhuǎn)成cDNA，然后用熒光定量PCR儀檢測3D4/21細胞中病毒基因PEDV-S、PEDV-M、PEDV-N的相對表達水平。以HRPT1作為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)分析及表達量的計算參考Fu等。引物序列見表4。
1.2.4 ML對PEDV感染3D4/21細胞基因表達的影響
①細胞處理。鋪4板24孔板，每孔加入500μL細胞培養(yǎng)液（密度為2.2×105個/mL）。根據(jù)ML的添加時間點不同，分為兩種處理方式（全時添加ML和PEDV感染細胞后添加ML）。每種處理方式有3組（control組、PEDV組、PEDV+ML組），每組4個重復。
細胞長滿單層棄去完全培養(yǎng)液，用PBS洗兩遍。
表3 DMEM定制培養(yǎng)液配方成分
處理方式1：全時添加ML。
control組和PEDV組加入500μL的RPMI 1640培養(yǎng)液，PEDV+ML組加入500μL含ML（濃度為10μmol/L）的RPMI 1640培養(yǎng)液。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h后，PEDV組和PEDV+ML組加入PEDV病毒稀釋液，待病毒吸附1 h后，棄去細胞上清液。control組和PEDV組每孔加入500μL RPMI 1640培養(yǎng)液，PEDV+ML組每孔加入500μL含ML（濃度為10μmol/L）的RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h。
表4基因的引物序列
處理方式2：PEDV感染細胞后添加ML。PEDV組和PEDV+ML組加入PEDV病毒稀釋液。病毒吸附1 h后，棄去細胞上清液。control組和PEDV組每孔加入500μL RPMI 1640培養(yǎng)液，PEDV+ML組每孔加入500μL含ML（濃度為10μmol/L）的RPMI1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h。
②基因相對表達量的測定方法。處理結(jié)束后收集細胞，提取RNA，檢測不同處理方式3D4/21細胞PEDV-S、PEDV-M、PEDV-N、IL-6、IL-8、IFN-β、MX1、ISG15、IFIT1、IFITM1、IFITM3、MMP13、KCNJ13等基因的相對表達量，引物序列見表4，以HRPT1作為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)分析及表達量的計算參考Fu等的方法。
試驗數(shù)據(jù)
用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件中的one-wayANOVA和Duncan’s多重比較，以P<0.05為差異顯著性標準。
十二酸單甘油酯對PEDV感染3D4/21巨噬細胞活性、基因表達的影響（一）
十二酸單甘油酯對PEDV感染3D4/21巨噬細胞活性、基因表達的影響（二）
十二酸單甘油酯對PEDV感染3D4/21巨噬細胞活性、基因表達的影響（三）
十二酸單甘油酯對PEDV感染3D4/21巨噬細胞活性、基因表達的影響（四）
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