本文研究了Latrepirdine（Dimebon）這種神經(jīng)活性化合物對α-突觸核蛋白（α-syn）相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的潛在治療作用。Latrepirdine已進(jìn)入阿爾茨海默病和亨廷頓病的二期臨床試驗(yàn)，顯示出增強(qiáng)認(rèn)知和神經(jīng)保護(hù)的能力。研究發(fā)現(xiàn)，Latrepirdine能刺激自噬，減少細(xì)胞和小鼠大腦中α-syn的積累，特別是在酵母、SH-SY5Y細(xì)胞和野生型小鼠模型中。研究表明，Latrepirdine對酵母中α-syn的細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用，且這種保護(hù)作用涉及自噬途徑的激活。在SH-SY5Y細(xì)胞中，Latrepirdine處理能減少α-syn的水平，并保護(hù)細(xì)胞免受其毒性影響。在小鼠模型中，長期給予Latrepirdine能增強(qiáng)自噬活性，降低大腦中的α-syn水平。這些發(fā)現(xiàn)支持Latrepirdine作為一種潛在的促自噬/抗神經(jīng)退行性化合物。盡管Latrepirdine在美國的II期臨床試驗(yàn)中未能成功，但研究者認(rèn)為這可能與α-syn在不同人群中的神經(jīng)病理學(xué)貢獻(xiàn)差異有關(guān)。因此，Latrepirdine可能對其他突觸核蛋白病癥，如帕金森病和路易體癡呆，具有更好的治療潛力。未來的研究將集中在評估Latrepirdine在這些疾病模型中的療效，以及探索其調(diào)節(jié)自噬途徑的具體作用機(jī)制。Latrepirdine的研究為開發(fā)針對α-syn相關(guān)疾病的新療法提供了有價(jià)值的見解，并強(qiáng)調(diào)了進(jìn)一步研究其臨床應(yīng)用的重要性。
Bioscreen全自動(dòng)生長曲線分析儀的應(yīng)用
Bioscreen C全自動(dòng)生長曲線分析儀主要用于測量B.velezensis SQR9及其衍生菌株的生長曲線。Bioscreen C系統(tǒng)通過每小時(shí)測量OD600值來監(jiān)測細(xì)菌在LB培養(yǎng)基或修改后的MSgg培養(yǎng)基中的生長情況。這種監(jiān)測是自動(dòng)化的，可以連續(xù)記錄細(xì)菌的生長情況，為研究者提供了關(guān)于細(xì)菌生長動(dòng)態(tài)的詳細(xì)信息。通過使用Bioscreen C全自動(dòng)生長曲線分析儀，研究者能夠評估不同條件下（如在不同鐵濃度的培養(yǎng)基中）B.velezensis SQR9及其衍生菌株的生長能力。這對于理解T7SS和YukE在細(xì)菌生長和鐵獲取中的作用至關(guān)重要，因?yàn)殍F是細(xì)菌生長的關(guān)鍵營養(yǎng)素。此外，通過比較野生型和突變株的生長曲線，研究者可以評估T7SS和YukE對細(xì)菌生長的影響。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Latrepirdine能夠保護(hù)酵母和分化的SH-SY5Y神經(jīng)元免受α-突觸核蛋白（α-syn）誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。這種保護(hù)作用可能是通過促進(jìn)自噬途徑實(shí)現(xiàn)的。研究表明，Latrepirdine通過激活自噬作用來減少α-syn的積累，這在酵母、SH-SY5Y細(xì)胞和野生型小鼠中都得到了證實(shí)。Latrepirdine可能是一個(gè)潛在的先導(dǎo)化合物，經(jīng)過優(yōu)化其促自噬和/或促神經(jīng)原活性后，可能對包括帕金森病、路易體癡呆、快速眼動(dòng)睡眠障礙和/或多系統(tǒng)萎縮在內(nèi)的突觸核蛋白病癥產(chǎn)生臨床益處。Latrepirdine在美國的II期試驗(yàn)失敗，可能部分原因是由于對Latrepirdine潛在分子機(jī)制的了解不足，以及α-syn在不同人群中對神經(jīng)病理學(xué)貢獻(xiàn)的差異。
圖1、latrepirdine可保護(hù)釀酒酵母免受α-syn的細(xì)胞毒性，但不能保護(hù)TDP-43、FUS或Htt-103Q的細(xì)胞毒性。(a)2XαSynstrain及其同源野生型(W303α)菌株在棉子糖培養(yǎng)基中生長到菌落中期，稀釋后分別點(diǎn)在YPG葡萄糖平板(α-syn“關(guān)閉”)和YPG半乳糖平板(α-syn開啟)上，在沒有或有l(wèi)atrepirdine的情況下(照片攝于生長2天后30℃下)。(b)W303α或(c)2XαSyn菌株在YPG半乳糖培養(yǎng)基(α-syn處于“開啟”狀態(tài))中，在沒有或有l(wèi)atrepirdine的情況下生長(濃度如圖所示)。(d)1XFUS、(e)2XTDP43和(f)1XHtt103Q菌株在YPG半乳糖培養(yǎng)基中生長(表達(dá)“開啟”)，沒有或有不同濃度的latrepirdine(如所示)。所有數(shù)據(jù)均為三個(gè)或三個(gè)以上獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖2、latrepirdine或雷帕霉素通過誘導(dǎo)自噬保護(hù)細(xì)胞免受與α-突觸核蛋白(α-syn)相關(guān)的細(xì)胞毒性。(a)在YTS158株系中，自噬體的成熟導(dǎo)致功能性堿性磷酸酶的激活。在合成培養(yǎng)基中生長至對數(shù)期后，在沒有或存在指定濃度的拉曲霉素(如所示)的情況下，測量YTS158染色體的堿性磷酸酶活性。(b)2xαSyn菌株在YPG半乳糖培養(yǎng)基(α-syn處于“開啟”狀態(tài))中生長，雷帕霉素存在或缺失(濃度如所示)。(c)Atg8Δ+2XαSyn培養(yǎng)物在YPGalactose培養(yǎng)基(α-syn處于“開啟”狀態(tài))中，在沒有或有不同濃度的雷帕霉素(濃度如所示)的情況下生長，并通過測量OD600監(jiān)測生長情況。(d)將2XαSyn、其同源野生型(W303α)和ATG8基因缺失的2XαSyn(Atg8Δ+2XαSyn)置于YPG半乳糖培養(yǎng)基(α-syn處于“開啟”狀態(tài))中，在30℃下振蕩培養(yǎng)。使用Bioscreen儀器，每隔1小時(shí)用OD600監(jiān)測細(xì)胞的生長情況。
圖3、latrepirdine能刺激α-synuclein(α-syn)的分解，并保護(hù)分化的SHSY5Y神經(jīng)元免受與α-syn相關(guān)的細(xì)胞毒性。使用視黃酸分化穩(wěn)定表達(dá)誘導(dǎo)性('tet-off')人α-syn的SH-SY5Y細(xì)胞(不含多西林(dox))，并在沒有(空白；不含dox)或有l(wèi)atrepirdine(不含dox)的情況下處理14天。(a)在10nM latrepirdine存在下處理14天的細(xì)胞被裂解，通過超速離心獲得Triton X-100可溶(S100，左)和不溶(P100，中)顆粒(' '為非特異性條帶)。用latrepirdine處理可減少Triton X-100可溶部分(單體減少=52.7%；s.e.m.=10.38；P<0.01)、總部分(單體減少=68.0%；s.e.m.=15.64；P<0.01)和不溶部分(聚集減少=74.8%；s.e.m.=9.397；P<0.001)中所有形式α-syn的水平，包括聚集體和可溶性單體。(b)對釋放到培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶(LDH)進(jìn)行定量；或(c)測量SH-SY5Y細(xì)胞中四氮唑MTS的還原度，以確定在沒有或存在一系列濃度的latrepirdine(如所示)的情況下細(xì)胞的存活率。(d)使用定量反轉(zhuǎn)錄酶-PCR分析α-syn mRNA水平，并與a-tubulin mRNA水平歸一化。(e)在無dox的情況下，將過表達(dá)β-半乳糖苷酶(β-gal)的誘導(dǎo)型SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，24小時(shí)后用視黃酸(RA)和不同濃度的latrepirdine(如所示)處理，并量化培養(yǎng)液中LDH的釋放。
圖4、latrepirdine刺激α-突觸核蛋白(α-syn)分解，同時(shí)增強(qiáng)自噬標(biāo)記物。兩個(gè)月大的野生型雄性小鼠連續(xù)21次腹腔注射3.5mg/kg latrepirdine(n=4；LAT)或等體積的空白(0.9%生理鹽水；n=4；VEH)。(a)對野生型小鼠大腦中可溶性α-syn、p62和LC3蛋白水平的Western印跡分析。(b-d)Western印跡條帶整合密度定量。圖示為具有代表性的同胎仔鼠；
總結(jié)
latrepirdine(Dimebon；dimebolin)是一種神經(jīng)活性化合物，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中與增強(qiáng)認(rèn)知、神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)發(fā)生有關(guān)，目前已進(jìn)入治療阿爾茨海默病和亨廷頓病(HD)的二期臨床試驗(yàn)階段。最近有跡象表明，latrepirdine能保護(hù)細(xì)胞免受與表達(dá)可聚集的神經(jīng)變性相關(guān)蛋白(包括Aβ42和γ-突觸核蛋白)有關(guān)的細(xì)胞毒性的影響，基于這一跡象，研究人員試圖確定latrepirdine是否能為釀酒酵母提供保護(hù)。在酵母中分別平行表達(dá)了幾種神經(jīng)變性相關(guān)蛋白，包括α-突觸核蛋白(α-syn)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥相關(guān)基因TDP43和FUS，以及具有103個(gè)多聚谷氨酰胺擴(kuò)增復(fù)制的HD相關(guān)蛋白Huntingtin(HTT基因；htt-103Q)。Bioscreen全自動(dòng)生長曲線分析儀在本研究中發(fā)揮了重要作用，為研究人員提供了一個(gè)精確、高效的工具來評估Latrepirdine對酵母細(xì)胞生長和蛋白毒性的影響，從而為理解Latrepirdine的潛在神經(jīng)保護(hù)機(jī)制提供了重要數(shù)據(jù)。在處理SH-SY5Y細(xì)胞或?qū)σ吧托∈筮M(jìn)行慢性處理后，還測定了latrepirdine對α-syn清除率和毒性的影響。latrepirdine只能保護(hù)酵母免受與α-syn相關(guān)的細(xì)胞毒性，而這似乎是通過誘導(dǎo)自噬發(fā)生的。進(jìn)一步研究表明長期服用latrepirdine可刺激分化的SH-SY5Y神經(jīng)元和小鼠大腦中α-syn的降解，同時(shí)提高自噬活性標(biāo)志物的水平。正在進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)將確定latrepirdine在α-syn神經(jīng)病理學(xué)轉(zhuǎn)基因小鼠模型中消減α-syn積累的效用。研究認(rèn)為latrepirdine可能是發(fā)現(xiàn)強(qiáng)效促自噬/抗神經(jīng)變性化合物的新型支架，在優(yōu)化其促自噬和促神經(jīng)源活性后，可能會(huì)對包括帕金森病、路易體癡呆、快速眼動(dòng)(REM)睡眠障礙和/或多系統(tǒng)萎縮在內(nèi)的突觸核蛋白病癥產(chǎn)生臨床益處。
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