近年來，關于吸煙對人體危害的研究越來越深入。研究表明，吸煙可引起多種常見疾病，如肺癌、支氣管炎、肺氣腫、心血管疾病等。此外，口腔是人體富含正常微生物群的部位，口腔微生態(tài)環(huán)境中微生物的數(shù)量和種類很易受外界環(huán)境的影響。然而，目前國內外針對香煙對口腔中微生物及相關疾病影響的研究卻相對較少，且結果相互矛盾。有研究認為香煙可改變口腔微環(huán)境從而有利于微生物的生長，增加口腔白斑及牙周疾病的發(fā)病率;也有研究認為香煙對口腔微生物沒有明顯影響，甚至還有研究認為吸煙可促進鏈球菌等口腔常見細菌的生長。因此，本文采取不同的方法觀察香煙對口腔微生物的影響，研究香煙與其生長之間的關系，以客觀評價香煙對口腔微生物的作用。
1材料與方法
1.1材料
試驗菌株為大腸埃希菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、銅綠假單胞菌(ATCC 25668)、白色假絲酵母(ATCC14053)、草綠色鏈球菌(自行分離);尼古丁(上海源葉生物科技有限公司)，香煙(泰山宏圖，焦油量12 mg，煙氣煙堿量1.1 mg，煙氣一氧化碳量1.2 mg，山東中煙工業(yè)有限責任公司生產);營養(yǎng)瓊脂、血瓊脂平板、磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)、麥氏比濁管(0.5個單位)等為自行配制。
1.2方法
1.2.1菌液的制備將上述菌株接種在相應培養(yǎng)基上，分離出單個菌落，分別選取其單個菌落混懸于生理鹽水中，稀釋至0.5麥氏單位的濁度，備用。
1.2.2尼古丁對口腔常見微生物的影響將尼古丁用PBS稀釋為400、40μg/mL;取40μL已稀釋的菌液置于無菌EP管中，按1∶1的比例分別與400、40、0μg/mL的尼古丁均勻混合，置于恒溫震蕩器中(37℃，220 r/min)震蕩作用6 h，將草綠色鏈球菌與各濃度尼古丁的混合液按照1∶1000比例進行稀釋。同理，大腸埃希菌、金黃色等等球菌、銅綠假單胎菌、白色假絲酵母菌等菌液混合液按照1∶1000、1∶1000、1∶1000、1∶100比例進行稀釋。分別取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色假絲酵母菌的稀釋液50μL滴于普通平板中，傾倒適量已高壓滅菌的保溫60℃的營養(yǎng)瓊脂(白色假絲酵母菌用沙保羅瓊脂)，輕輕晃動平板使之均勻混合，待其冷卻后，置于恒溫培養(yǎng)箱內37℃培養(yǎng)24 h;取草綠色鏈球菌與尼古丁的混合液50μL置于血平板表面，將菌液涂抹均勻，放置于恒溫培養(yǎng)箱內37℃培養(yǎng)48 h。取出上述培養(yǎng)物查看生長情況并進行菌落計數(shù)，各菌均設3個重復。
1.2.3煙草浸出液對口腔微生物的影響將20支香煙的煙絲取出，置于裝有50 mL無菌蒸餾水的潔凈離心管內，37℃水浴24 h，5000 r/min離心15 min，取上清液用0.22μm的濾菌器過濾除菌，然后進行1∶10、1∶100稀釋，參照1.2.2的方法使菌液與煙草浸出液混合作用6 h后，分別采取瓊脂稀釋法和涂布法進行菌落計數(shù)。
1.2.4煙霧提取物對口腔微生物的影響將無菌蒸餾水20 mL置于水煙漏斗中，使水煙漏斗的出氣口與真空泵相連;取10支已去掉過濾嘴的香煙依次插于水煙漏斗進氣口處并點燃，開啟真空泵使其燃燒產生的煙霧進入水煙漏斗并溶解于無菌蒸餾水，每只香煙均控制在10 min左右燃燒完。將水煙漏斗中的煙霧水溶液倒入試管中，進行高壓蒸汽滅菌。將滅菌后的煙霧水溶液用0.22μm的濾菌器過濾除菌，并進行1∶10、1∶100稀釋，參照1.2.2的方法將菌液與煙草浸出液的混合作用6 h后，分別采取瓊脂稀釋法和涂布法進行菌落計數(shù)。
1.2.5吸煙對志愿者口腔中微生物的影響召集青島大學醫(yī)學院2011級吸煙(平均吸煙10支/d，時間為3 a以上)和不吸煙的男生各25名，清晨待志愿者使用課題組統(tǒng)一提供的牙膏刷牙后，每名志愿者取10 mL生理鹽水漱口30 s，分別吐入潔凈的無菌紙杯中;取1 mL漱口液置于試管中，然后稀釋1000倍，將稀釋液各取50μL涂布血平板表面，放入37℃孵箱培養(yǎng)48 h，觀察不同形態(tài)的菌落，并通過革蘭染色和生化試驗對出現(xiàn)頻率較高的菌落進行初步鑒定，分別進行計數(shù)。
1.2.6統(tǒng)計學處理采用SPSS12.0軟件進行，方法為兩獨立樣本資料的t檢驗，方差不齊時用t'檢驗。
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