2結(jié)果與分析
2.1噬菌體形態(tài)觀察
以耐多藥奇異變形桿菌為宿主菌，從污水中分離出一株新裂解性噬菌體，命名為vB_PMC-PL1（以下簡(jiǎn)稱PL1）。噬菌體PL1在雙層平板上形成了規(guī)則、均勻且透亮的噬菌斑，大小為1 mm（圖1A）。通過透射電鏡觀察，噬菌體PL1頭部直徑為（91.43±2）nm，尾長(zhǎng)（133.20±2）nm，為長(zhǎng)尾噬菌體（圖1B）。
圖1噬菌斑形態(tài)（A）和噬菌體形態(tài)（B）
2.2噬菌體最佳MOI和一步生長(zhǎng)曲線
MOI和一步生長(zhǎng)曲線是評(píng)價(jià)噬菌體裂解活性的重要指標(biāo)，對(duì)指導(dǎo)噬菌體治療使用劑量或食品安全應(yīng)用具有重要意義。如圖2A所示，噬菌體PL1 MOI為0.1時(shí)，噬菌體效價(jià)最高，為10.34（lg（PFU/mL）），因此噬菌體PL1最佳MOI為0.1。按照最佳MOI繪制一步生長(zhǎng)曲線（圖2B），由結(jié)果可知噬菌體PL1的潛伏期為20 min，裂解量為106 PFU/cell。結(jié)果表明，噬菌體PL1對(duì)細(xì)菌有著良好的裂解能力。
圖2最佳MOI（A）和一步生長(zhǎng)曲線（B）
2.3噬菌體pH值穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性
優(yōu)良的環(huán)境穩(wěn)定性是噬菌體應(yīng)用的前提。由圖3A可知，噬菌體PL1在pH值范圍為3～11時(shí)活性穩(wěn)定，在pH值為2和12時(shí)噬菌體失活，結(jié)果表明噬菌體PL1具有較好的酸堿耐受性。由圖3B可知，噬菌體PL1在4～50℃條件下活性穩(wěn)定，當(dāng)溫度為60℃時(shí)，噬菌體完全失活，因此噬菌體PL1的最高耐受溫度為50℃。結(jié)果表明噬菌體PL1具有較好的環(huán)境穩(wěn)定性，可以應(yīng)用于多種環(huán)境。
圖3噬菌體PL1 pH值穩(wěn)定性（A）和溫度穩(wěn)定性（B）
2.4不同MOI下噬菌體裂解效果
通過測(cè)定噬菌體PL1在不同MOI下的裂解活性來評(píng)價(jià)其抑菌能力。由圖4可知，在12 h內(nèi)各處理組OD600 nm值均有一定的增長(zhǎng)，但均低于陽性對(duì)照，表明噬菌體PL1在低MOI下能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。
圖4不同MOI值噬菌體PL1裂解曲線
2.5噬菌體宿主范圍
由表1可知，噬菌體PL1能裂解奇異變形桿菌和普通變形桿菌，但對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌沒有裂解活性，表明噬菌體PL1對(duì)變形桿菌屬顯示出宿主特異性。
表1噬菌體PL1宿主范圍
注：+.裂解，-.不裂解，PM.奇異變形桿菌，PV.普通變形桿菌。
2.6噬菌體全基因組分析
作為食品生物防治劑，噬菌體不能攜帶抗生素耐藥基因、毒力基因等有害基因。為明確噬菌體PL1可否用于食品生物防治劑，對(duì)其全基因組分析，通過測(cè)序結(jié)果可知，噬菌體PL1的全基因組全長(zhǎng)為103 381 bp，GC相對(duì)含量為38.89%。使用RAST注釋軟件共預(yù)測(cè)了158個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF），包括18個(gè)tRNA和140個(gè)其他類型的ORF，其中有63個(gè)ORF編碼的功能蛋白已被注釋。使用上述工具檢測(cè)得出噬菌體PL1不攜帶抗生素抗性基因、毒力基因和整合酶相關(guān)基因（圖5），具有良好的生物安全性。
圖5噬菌體PL1基因圈圖
2.7噬菌體進(jìn)化樹分析
使用NCBI比對(duì)噬菌體PL1末端酶大亞基的相關(guān)基因序列并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)最新分類標(biāo)準(zhǔn)，表明噬菌體PL1是Demerecviridae家族Novosibvirus屬的一個(gè)新成員（圖6）。
圖6基于噬菌體PL1末端酶大亞基基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析
2.8噬菌體對(duì)生物被膜形成抑制能力測(cè)定結(jié)果
生物被膜是保護(hù)細(xì)菌免受外部環(huán)境影響的重要屏障，使細(xì)菌對(duì)抗菌劑、消毒劑等抗菌方式產(chǎn)生抗性。能否有效抑制或清除細(xì)菌生物被膜是檢驗(yàn)噬菌體PL1應(yīng)用指標(biāo)之一。經(jīng)過培養(yǎng)，測(cè)定PM B2在24、48 h和72 h時(shí)生物被膜OD595 nm值分別為0.97、1.20和0.79，PM B2生物被膜最佳形成時(shí)間為48 h。圖7表明，按照不同MOI加入噬菌體PL1后，與對(duì)照組相比48 h內(nèi)處理組均能顯著地抑制細(xì)菌生物被膜的形成。
圖7不同MOI下噬菌體PL1對(duì)生物被膜形成的影響
2.9噬菌體對(duì)生物被膜清除能力
如圖8A可知，與對(duì)照組相比，噬菌體PL1可以顯著降低細(xì)菌生物被膜含量，生物被膜清除率高達(dá)53.51%。經(jīng)噬菌體PL1處理12 h后，生物被膜中的細(xì)菌濃度降低了1.44（lg（CFU/mL））；噬菌體PL1處理36 h，細(xì)菌濃度降低了1.00（lg（CFU/mL））（圖8B）。結(jié)果表明，噬菌體PL1能有效清除奇異變形桿菌成熟生物被膜。
圖8噬菌體PL1對(duì)細(xì)菌成熟生物被膜（A）和生物被膜內(nèi)活菌（B）的清除能力
2.10噬菌體對(duì)不同材料上的細(xì)菌清除能力
在食品生產(chǎn)中，細(xì)菌易在不同材料上定殖形成生物被膜且不易被清除，導(dǎo)致食品受到細(xì)菌污染。結(jié)果顯示，經(jīng)噬菌體PL1處理12 h后，高密度聚乙烯上細(xì)菌含量由7.76（lg（CFU/cm2））下降到6.39（lg（CFU/cm2）），清除率為95.72%（圖9A）；不銹鋼材料上細(xì)菌數(shù)量下降了1.24（lg（CFU/cm2）），清除率達(dá)到94.33%（圖9B）。處理36 h后，噬菌體對(duì)兩種材料上細(xì)菌的清除率均高于90.00%，表明噬菌體PL1對(duì)不同材料上生物被膜有較強(qiáng)的清除作用。
圖9噬菌體PL1對(duì)高密度聚乙烯（A）和不銹鋼上（B）生物被膜清除作用
2.11噬菌體在雞胸肉中的抑菌能力測(cè)定
在生雞肉中奇異變性桿菌的檢出率遠(yuǎn)高于其他肉類。因此，本研究選用雞胸肉評(píng)價(jià)噬菌體PL1的抑菌作用。如圖10A所示，與對(duì)照組相比，在4℃條件下，按MOI分別為1 000和10 000加入噬菌體PL1處理6 h后，雞胸肉中細(xì)菌數(shù)量分別減少0.95（lg（CFU/g））和1.01（lg（CFU/g））。由圖10B所示，與對(duì)照組相比，在25℃條件下，按MOI分別為1 000和10 000加入噬菌體處理9 h后細(xì)菌數(shù)量分別減少了1.50（lg（CFU/g））和1.67（lg（CFU/g））。在不同溫度下，經(jīng)噬菌體PL1處理12 h，與對(duì)照組相比均能顯著減緩細(xì)菌的增長(zhǎng)。結(jié)果表明，噬菌體PL1能有效抑制雞胸肉中細(xì)菌的增長(zhǎng)。
圖10 4℃（A）和25℃（B）條件下不同MOI噬菌體PL1對(duì)雞胸肉中細(xì)菌的抑制作用
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