ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是由25～35個(gè)L-賴氨酸單體通過(guò)ε-氨基和α-羧基脫水縮合形成的一種同型氨基酸聚合物。ε-PL具有抑菌范圍廣、安全無(wú)毒和熱穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，故廣泛用作食品防腐劑，目前已被多個(gè)國(guó)家使用。
ε-PL的發(fā)酵工藝主要為pH控制策略。KAHAR等開(kāi)創(chuàng)了兩階段pH控制策略，即發(fā)酵前期(2 d)將pH控制在5.0以上，獲得更高的菌體量；后期將pH控制在4.0左右，快速合成ε-PL。經(jīng)過(guò)連續(xù)8 d補(bǔ)料分批發(fā)酵，ε-PL產(chǎn)量達(dá)到48.3 g/L，成為當(dāng)時(shí)的領(lǐng)先水平。任喜東等建立了一種pH沖擊策略發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL模式。前期控制pH為5.0，隨后讓pH自然下降，經(jīng)12 h左右的沖擊(pH 3.0)后回調(diào)pH值至4.0左右，直至發(fā)酵結(jié)束。同樣經(jīng)過(guò)連續(xù)8 d補(bǔ)料分批發(fā)酵，ε-PL產(chǎn)量達(dá)到54.7 g/L。大量研究表明，發(fā)酵過(guò)程中將pH控制在4.0左右是S.albulus積累ε-PL的先決條件。目前，關(guān)于低pH促進(jìn)S.albulus高產(chǎn)ε-PL的原因主要有2種觀點(diǎn)，第1種觀點(diǎn)認(rèn)為，低pH能夠有效的抑制ε-PL降解酶(PL dehydrogenase,Pld)的酶活，防止產(chǎn)生的ε-PL被降解；第2種觀點(diǎn)認(rèn)為，ε-PL合成酶(PL synthetase,Pls)是一種依賴于ATP的非核糖體肽合成酶，低pH環(huán)境有利于胞內(nèi)ATP的積累，從而促進(jìn)ε-PL的合成。
然而，低pH除了影響Pld酶活和胞內(nèi)ATP濃度之外，還會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)速率產(chǎn)生影響，而生長(zhǎng)速率的不同又會(huì)影響微生物的代謝流分布。王澤建等研究發(fā)現(xiàn)：在糞產(chǎn)堿桿菌中，隨著比生長(zhǎng)速率的升高(0.05 h-1到0.29 h-1)，葡萄糖流向菌體生長(zhǎng)的比例從18%增加到了47%，流向凝膠多糖合成的碳去向分布由45%降低到了12%；在高比生長(zhǎng)速率的情況下，更多的碳源流向菌體的生長(zhǎng)以及副產(chǎn)物的生成。那么比生長(zhǎng)速率是否也是影響ε-PL合成的一個(gè)重要原因呢？目前關(guān)于菌體比生長(zhǎng)速率對(duì)ε-PL合成的影響尚未有研究報(bào)道。因此，本研究將通過(guò)恒化培養(yǎng)方式，研究不同pH和菌體比生長(zhǎng)速率對(duì)S.albulusM-Z18合成ε-PL的影響。
pH對(duì)S.albulus M-Z18分批發(fā)酵的影響
微生物的生長(zhǎng)需要一定的酸堿度，鏈霉菌的最適生長(zhǎng)pH為中性偏堿性。pH通過(guò)影響微生物細(xì)胞膜的電荷、酶活、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和中間代謝產(chǎn)物的解離等進(jìn)而影響微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。pH對(duì)S.albulusM-Z18分批發(fā)酵結(jié)果如圖1所示，隨著分批發(fā)酵進(jìn)行，pH值由初始6.8逐步下降至pH 5.5(13 h)、pH 5.0(14 h)、pH 4.0(14.5 h)和pH 3.5(15 h)，隨后依靠自動(dòng)流加氨水將分批發(fā)酵過(guò)程控制在不同的pH進(jìn)行。由圖1-a可知，不同pH對(duì)S.albulusM-Z18菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生了顯著影響，受控pH越高，發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體量就越高，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期研究保持一致。pH 3.5時(shí)，最終生物量為(11.62±0.40)g/L，僅為pH 5.5時(shí)的一半[(22.53±0.42 g/L]。另外，在分批發(fā)酵分別達(dá)到受控pH值后(15 h)，μpH 3.5約為0.04 h-1，μpH4.0約為0.07 h-1，μpH 5.0約為0.10 h-1，μpH 5.5約為0.13 h-1(圖1-b)，表明分批發(fā)酵受控pH,pH值越小，S.albulusM-Z18比生長(zhǎng)速率越低。然而，ε-PL產(chǎn)量在pH 3.5時(shí)最高，達(dá)到(5.24±0.10)g/L；當(dāng)pH高于5.0時(shí)，發(fā)酵液中檢測(cè)不到ε-PL(圖1-c)。通過(guò)對(duì)ε-PL比合成速率分析發(fā)現(xiàn)，ε-PL快速合成階段主要集中于18～27 h左右。24 h之后，ε-PL比合成速率顯著下降。在大部分時(shí)間里，pH 3.5時(shí)ε-PL比合成速率高于pH 4.0時(shí)(圖1-d)。因此，S.albulusM-Z18在低pH環(huán)境下積累ε-PL與菌體生長(zhǎng)速率存在一定關(guān)聯(lián)。
a-菌體生長(zhǎng)；b-比生長(zhǎng)速率；c-ε-PL產(chǎn)量；d-ε-PL比合成速率圖1 pH值對(duì)分批發(fā)酵過(guò)程參數(shù)的影響
pH對(duì)S.albulus M-Z18恒化培養(yǎng)積累ε-PL的影響
恒化培養(yǎng)可以通過(guò)改變稀釋率及限制性基質(zhì)的種類和濃度靈活地控制微生物細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率。通過(guò)恒化培養(yǎng)可以使微生物細(xì)胞達(dá)到“穩(wěn)態(tài)”，故常常被用于微生物生理方面的研究。本文通過(guò)控制D=0.04 h-1，研究不同pH(4.0，4.5，5.0)對(duì)S.albulusM-Z18合成ε-PL的影響(在稀釋率為0.04 h-1時(shí)，pH 3.5不能建立恒化體系)，如圖2a-c所示，隨著pH值升高，S.albulusM-Z18生物量逐漸增大，而ε-PL質(zhì)量濃度逐漸減小。在pH 4.0時(shí)，生物量為(8.19±0.05)g/L，ε-PL濃度為(2.43±0.04)g/L；在pH 5.0時(shí)，生物量為(12.19±0.14)g/L，ε-PL質(zhì)量濃度為(0.76±0.02)g/L；在pH 5.5時(shí)，生物量為(15.63±0.09)g/L，ε-PL質(zhì)量濃度為0 g/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH值對(duì)于恒化條件下的菌體生長(zhǎng)和ε-PL合成影響，與上述分批發(fā)酵結(jié)果基本一致：低pH有利于ε-PL合成，而不利于菌體生長(zhǎng)。進(jìn)一步動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，隨著pH值降低，細(xì)胞得率(YX/S)逐漸減小，葡萄糖比消耗速率(qS)逐漸增大，ε-PL比合成速率(qP)也逐漸增加。特別是在pH 4.0時(shí)，YX/S最低(0.376 g/g)，qS最高(0.106 g/(g·h))，qP最大(0.012 g/(g·h))(表1)。這表明，低pH時(shí)，細(xì)胞會(huì)快速消耗葡萄糖用于ε-PL的合成。胞內(nèi)ATP濃度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖2-d)，在pH 4.0時(shí)，胞內(nèi)ATP濃度最高為(7.11±0.80)nmol/mg蛋白，而pH 5.0與pH 5.5胞內(nèi)ATP濃度分別只有(4.23±0.43)和(2.66±0.70)nmol/mg蛋白。這表明，pH值越低越有利于胞內(nèi)ATP積累。事實(shí)上，ε-PL合成依靠的ε-PL合成酶是一種依賴于ATP濃度的非核糖體肽合成酶，即ATP濃度越高，酶活越高，ε-PL合成速率就越快。另外，已有的研究表明S.albulus中存在2種ε-PL分解酶，它們的最適pH為7.0左右，且酶活會(huì)隨著pH降低而逐漸減小，在pH 4.0時(shí)酶活基本喪失。綜上，在菌體比生長(zhǎng)速率相同情況下，低pH一方面抑制了分解酶活性，另一方面使得底物葡萄糖更多地用于ATP和ε-PL合成，從而有利于ε-PL積累。
a-pH 4.0；b-pH 5.0；c-pH 5.5；d-胞內(nèi)ATP含量圖2 S.albulus M-Z18在不同pH下的恒化培養(yǎng)(D=0.04 h-1)過(guò)程參數(shù)和胞內(nèi)ATP含量
表1不同pH值下S.albulus M-Z18恒化培養(yǎng)(D=0.04 h-1)動(dòng)力學(xué)參數(shù)
2.3比生長(zhǎng)速率對(duì)恒定pH 4.0條件下S.albulus M-Z18合成ε-PL的影響
S.albulusM-Z18在pH 4.0條件下，不同稀釋率的恒化培養(yǎng)體系中達(dá)到“穩(wěn)態(tài)”時(shí)(D=0.08 h-1有輕微洗脫現(xiàn)象)，μ=0.04、0.06和0.08 h-1的生物量分別為(8.19±0.05)、(7.83±0.04)和(6.81±0.07)g/L；ε-PL濃度分別為(2.43±0.04)、(2.29±0.06)和(1.68±0.06)g/L(圖3a-c)。隨著菌體比生長(zhǎng)速率的增加(稀釋率升高)，qS和qP均呈逐漸增加趨勢(shì)(表2)。相比于D=0.04 h-1、D=0.06 h-1時(shí)，qS和qP分別提高了43%和50%；相比于D=0.06 h-1、D=0.08 h-1時(shí)，qS提高了70%，而qP只提高了11%。
表2不同稀釋率S.albulus M-Z18恒化培養(yǎng)(pH 4.0)動(dòng)力學(xué)參數(shù)
另外，不同稀釋率恒化體系中菌體胞內(nèi)ATP濃度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，稀釋率為0.04、0.06和0.08 h-1時(shí)，胞內(nèi)ATP濃度分別為(7.11±0.80)、(12.98±0.45)和(16.06±1.41)nmol/mg蛋白。相比于D=0.04 h-1、D=0.06 h-1胞內(nèi)ATP增加了82.5%左右，約6 nmol/mg蛋白。而相比于D=0.06 h-1、D=0.08 h-1胞內(nèi)ATP僅增加了23.7%，約3 nmol/mg蛋白。綜上，在恒定pH 4.0時(shí)，菌體比生長(zhǎng)速率越高，底物葡萄糖消耗速率、ε-PL比生成速率和胞內(nèi)ATP濃度就越大，而細(xì)胞得率和ε-PL得率(YP/S)卻在總體下降。由此可以看出，隨著菌體比生長(zhǎng)速率提高，底物葡萄糖消耗速率加快，更多的葡萄糖流向了菌體合成和ATP生產(chǎn)，但是ε-PL比生成速率提高不顯著，而YP/S下降明顯(特別是在D=0.08 h-1時(shí))，故過(guò)高的菌體比生長(zhǎng)速率會(huì)降低發(fā)酵的經(jīng)濟(jì)性。因此，在發(fā)酵過(guò)程中，除了將pH控制在合適范圍內(nèi)，也需要調(diào)節(jié)菌體的生長(zhǎng)速率保持在合理區(qū)間(如0.06 h-1左右)，才能實(shí)現(xiàn)ε-PL的最高效發(fā)酵。
a-0.04 h-1；b-0.06 h-1；c-0.08 h-1；d-胞內(nèi)ATP含量圖3 S.albulus M-Z18在不同稀釋率的恒化培養(yǎng)(pH=4.0)過(guò)程參數(shù)和胞內(nèi)ATP含量
3結(jié)論
為了探究ε-PL發(fā)酵過(guò)程的關(guān)鍵影響因素，本文從發(fā)酵動(dòng)力學(xué)角度，分析了pH值和菌體比生長(zhǎng)速率對(duì)ε-PL發(fā)酵過(guò)程參數(shù)的影響。研究結(jié)果表明，發(fā)酵過(guò)程控制pH在4.0左右，不僅可以抑制ε-PL分解酶活性，同時(shí)使得底物葡萄糖更多地用于ATP和ε-PL合成，從而有利于ε-PL的積累；另外，維持菌體比生長(zhǎng)速率在合理區(qū)間(0.06 h-1左右)，也是獲得ε-PL高效積累的重要控制條件。因此，在發(fā)酵過(guò)程中將pH控制在較低水平，不僅能夠抑制分解酶活性、提高胞內(nèi)ATP濃度，還可以將菌體生長(zhǎng)控制在合適的速率范圍，最終共同調(diào)控了ε-PL大量積累?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，在ε-PL補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程中(pH沖擊模式)，當(dāng)菌體增長(zhǎng)緩慢時(shí)，可通過(guò)流加有機(jī)氮源(如酵母粉)促進(jìn)菌體生長(zhǎng)；而當(dāng)菌體增長(zhǎng)過(guò)快，可通過(guò)適當(dāng)下調(diào)pH，以維持細(xì)胞比生長(zhǎng)速率在0.06 h-1左右，進(jìn)一步達(dá)到高產(chǎn)ε-PL的目的。
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