1.3.2氨氮降解菌的分離純化
配制好分離平板培養(yǎng)基，滅菌、分裝、冷卻后，取第2次富集培養(yǎng)基中的上清菌液1 mL，在無菌操作條件下將培養(yǎng)液稀釋、涂布于分離平板培養(yǎng)基上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3天，至平板長出單菌落為止；挑取各個單菌落至新的平板上劃線，28℃下培養(yǎng)2～3天，至平板上長出單菌落為止，以進(jìn)一步純化；挑選各個單菌落于斜面培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)24 h；待斜面長出菌苔后，分別以斜面固態(tài)保藏于4℃冰箱和中制成甘油管保藏于-20℃冰箱中。
1.3.3制備菌懸液及測定細(xì)胞濃度
將活化后的各菌種接入搖瓶種子培養(yǎng)基；各接入1環(huán)，于150 r/min、28℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h；在4℃、10000 r/min下離心15 min并棄上清液，收集菌體；將濕菌體加至無菌的生理鹽水中洗滌3～4次，測定OD600=1，并將其配制成細(xì)胞濃度約為109個/mL的菌懸液備用。
1.3.4篩選高效降解菌
制備搖瓶篩選培養(yǎng)基190 mL加入1000 mL的三角瓶中，滅菌、冷卻后，分別接入各菌株的細(xì)胞濃度相等的菌懸液；置于150 r/min、28℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72 h；采用《水楊酸分光光度法》分析經(jīng)各菌種降解后的培養(yǎng)基中的氨氮殘留量(24，48，72 h各測1次)；用未接種的搖瓶做參照，記錄數(shù)據(jù)并計算氨氮降解率，并按式(1)計算菌株的氨氮降解率：
綜合數(shù)據(jù)，根據(jù)降解率的大小，優(yōu)選出降解效率最高的目的菌株。
1.3.5高效降解菌菌株最大吸收波長的測定
配制好100 mL活化培養(yǎng)基，滅菌、冷卻后，將優(yōu)選出的菌株在活化培養(yǎng)基中活化24 h(將斜面保藏的菌種接1環(huán)到活化培養(yǎng)基中，置于28℃和150 r/min條件下培養(yǎng)24 h)，取培養(yǎng)液用紫外-可見光分光光度儀在340～600 nm的波長下以未接種的培養(yǎng)基為參比測定其OD值，以波長為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)畫圖，確定該優(yōu)選菌株的最大吸收波長。
1.3.6高效降解菌菌株的生長曲線測定
將活化好的優(yōu)選菌株，接1環(huán)至新鮮的活化培養(yǎng)基，在28℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，在該優(yōu)選菌株的最大吸收波長處，每隔2 h取一定量培養(yǎng)液測定其OD值，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，以最大吸收波長處的OD值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。
1.3.7氨氮降解菌菌株的初步鑒定
對優(yōu)選菌種進(jìn)行平板培養(yǎng)、革蘭氏染色，觀察其菌落形態(tài)及革蘭氏屬性。同時，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》的方法，對生理生化特征等方面進(jìn)行初步鑒定，如葡萄糖發(fā)酵試驗、需氧性試驗等。
1.3.8菌株的16S rDNA測序
氨氮降解菌菌株的16S rDNA PCR擴增引物采用通用引物：正向引物27F為5′-AGAGTTTGATCC-TGGCTCA-3′，反向引物1492R為5′-GGTTACCTTG-TTACGACTT-3′(由上海生物工程有限公司合成)，擴增產(chǎn)物電泳檢測后送上海生物工程有限公司測序，將測得序列通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行BLAST比對，找出核酸數(shù)據(jù)庫中與氨氮降解菌菌株同源性較高的菌株序列，下載這些菌株的DNA序列，然后用生物軟件MEGA4進(jìn)行CLUSTAL比對并構(gòu)建氨氮降解菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。
2實驗結(jié)果
2.1分離篩選高效氨氮降解菌的結(jié)果
富集實驗的情況如下：第1天富集后pH為6.10；第2天為4.5，說明富集的菌株是產(chǎn)酸的；分離純化試驗：從泡菜原材料中共篩選了25株能降解高濃度氨氮的菌株；最后對這25株菌進(jìn)行了氨氮降解率的測定實驗。結(jié)果表明：在氨氮濃度為500 mg/L的液體培養(yǎng)基下，24 h內(nèi)這些菌株氨氮降解率的范圍為3.85%～29.81%；48 h的氨氮降解率范圍為13.46%～43.64%，72 h的氨氮降解范圍為35.72%～64.85%。由于硫酸銨在培養(yǎng)基滅菌過程中會出現(xiàn)高溫分解，從而導(dǎo)致NH4-N的濃度降低，因此在培養(yǎng)基的配制過程中采用先不加硫酸銨滅菌后，通過過濾除菌將硫酸銨加入到培養(yǎng)基中后接種培養(yǎng)。試驗表明：LJK8菌株的降解率最高為64.85%，因此對LJK8菌株做進(jìn)一步的研究。
2.2 LJK8菌株最大吸收波長的測定
LJK8菌株吸收波長實驗結(jié)果見圖1。
圖1 LJK8菌株吸收波長
由圖1可知，在波長340～600 nm之間，LJK8菌株在380 nm處有最大吸收峰，由此在380 nm處測其生長曲線，以研究其生長量與氨氮降解率之間的關(guān)系。
2.3 LJK8菌株的生長曲線測定
LJK8菌株的生長曲線測定結(jié)果見圖2。
圖2 LJK8菌株的生長曲線
由圖2可知，LJK8菌株在0～6 h為生長的適應(yīng)期；在6～14 h為對數(shù)生長期；在14～36 h為生長的穩(wěn)定期；在36 h之后才有所衰亡。LJK8菌株達(dá)到最大生長量是在培養(yǎng)第20 h。
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