桑黃（Phellinus baumii.）是一種食藥用真菌，利用沸水可提取其子實體抑菌成分。通過選取乳制品中常見的、具有代表性的有害指示菌，研究了不同濃度的桑黃水提物對革蘭氏陽性菌、陰性菌，霉菌和酵母的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)：桑黃水提物在1—10 mg/mL作用濃度下，實現(xiàn)了對牛乳中有害細菌、真菌有效的抑制，能顯著控制巴殺牛乳中菌群總數(shù)的變化，同時對有益菌無顯著影響，相對Nisin等抑菌劑具有廣譜抑菌性。
隨著國民經(jīng)濟的不斷提高，我國乳品行業(yè)已步入了快速發(fā)展時期，消費市場對乳制品的品質(zhì)要求也在不斷提高。開發(fā)針對不同消費人群的、具有特殊生理功能的高品質(zhì)乳制品成為我國乳業(yè)發(fā)展的一個新方向。而目前國內(nèi)外乳品微生物污染事故頻發(fā)，如2000年日本雪印旗下三款產(chǎn)品檢出金黃色葡萄球菌超標，2002年美國惠氏生產(chǎn)的乳粉被檢出阪崎桿菌超標等［1］。由于乳制品中含有豐富的營養(yǎng)成分，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、乳糖、維生素等，在乳制品的生產(chǎn)流通以及儲存過程容易受到微生物的污染。因而，抑菌問題成為開發(fā)特色高品質(zhì)乳制品重要的環(huán)節(jié)之一。
乳制品的抑菌方式主要有內(nèi)源成分抑菌和外源物質(zhì)添加抑菌［2］。如目前研究最深、應用最廣的是乳酸鏈球菌肽（Nisin），Nisin能有效地控制食品中的有害細菌［3］，特別是耐熱的芽孢桿菌及梭菌的生長和繁殖，以達到延長不同乳制品貨架期的目的。Nisin能夠有效控制革蘭氏陽性菌的生長繁殖，但對革蘭氏陰性菌、酵母以及霉菌不具有抑制作用［4-5］。因而，與乳制品內(nèi)源性抑菌物質(zhì)相比，外源添加抑菌成分有作用范圍小、不具廣譜抑菌性的弊端。開發(fā)一種天然、安全的外源抑菌成分應用于乳制品的抑菌具有重要的意義。
桑黃（Phellinus spp.）作為一種珍貴的傳統(tǒng)食藥用真菌，是國際認同的食品領域中相率最高的一種食藥用真菌［6-7］。目前，對于桑黃子實體水提物的生物活性有諸多報道，如抗氧化［8］、抗腫瘤［9］、抗衰老、提高免疫力、抗纖維化、抗肺炎［10-13］等功效。本研究通過研究桑黃子實體水提物的抑菌性，并應用于乳制品，考察桑黃子實體水提物對保鮮乳中菌群總數(shù)的影響，旨在為開發(fā)一種天然、安全、性能佳的乳制品抑菌劑做部分基礎工作。
1材料與方法
1．1原料與儀器
PDA培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基購于國藥集團，按藥品說明取固體粉末加去離子水溶解后，121℃滅菌15 min后，待用；MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基購于德國默克公司，按藥品說明取固體粉末溶解后，121℃滅菌15 min后，待用；指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、宋內(nèi)氏志賀氏菌（Shigella Castellani）、沙門氏菌（Salmonella）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、青霉（Penicillium candidum）、白霉（Geotrichum candidum）、酵母菌種（Saccharomyces cerevisiae）保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）以及雙歧桿菌（Bifidobacterium），以上菌種保存于光明乳業(yè)股份有限公司菌種庫；桑黃（Phellinus baumii.）保存于中國微生物菌種保藏中心上海食用菌分中心。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀，購于芬蘭Bioscreen公司；高壓蒸汽滅菌鍋HVE-50，購于HIRAYAMA公司；超凈工作臺TH-CB-402，購于LABCONCO公司。
1．2桑黃水提物的制備
將桑黃菌種栽培得到子實體后，將子實體粉碎至約1 cm3的顆粒，在干燥的子實體粉碎物中加入20倍體積的去離子水，沸水提取2 h，濾得殘渣進行二次提??；合并兩次提取液并進行濃縮，4 000 r/min離心10 min去除沉淀；將乙醇加入濃縮液中，至乙醇終濃度為90%，室溫下靜置24 h后，將離心后沉淀部分加去離子水溶解，再次離心去除不溶物質(zhì)；將上清進行透析12 h，透析后溶液進行冷凍干燥，即得桑黃水溶性提取物，115℃滅菌15 min后使用。
1．3革蘭氏陰性菌抑制試驗
抑菌方法參照ZHAO［14］并稍作改動。取桑黃水提物分別用無菌去離子水配制成0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL溶液，待用；取大腸桿菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌、沙門氏菌分別進行菌種復蘇后，將菌體接種于液體肉湯培養(yǎng)基37℃下振蕩培養(yǎng)18 h，調(diào)節(jié)培養(yǎng)后菌液中菌種濃度為105—106個/mL，取1 mL調(diào)節(jié)后菌液與呈液態(tài)的肉湯瓊脂培養(yǎng)基混合均勻后倒至培養(yǎng)皿中；待培養(yǎng)基凝固后，將20μL不同濃度桑黃水提物溶液滴在混有有害微生物的固體培養(yǎng)基上，以20μL無菌水作為對照組；37℃下靜置培養(yǎng)48 h后測量平板抑菌圈大小。
1．4革蘭氏陽性菌抑制試驗
抑菌方法參照ZHAO［14］并稍作改動。取桑黃水提物分別用無菌去離子水配制成0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL溶液，待用；取單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌以及枯草芽孢桿菌分別進行菌種復蘇，其余步驟參照“1.3革蘭氏陰性菌抑制試驗”。
1．5霉菌抑制試驗
參照文獻［15］的方法，并略做改動。將滅菌后桑黃水提物與PDA培養(yǎng)基混合均勻，使桑黃水提物終濃度為0.1 mg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL，倒入平板凝固后，以空白PDA固體培養(yǎng)基為對照；取青霉、白霉菌株分別進行活化并進行固體擴大培養(yǎng)，7 d后分別挑取青霉、白霉菌種于平板中心，30℃培養(yǎng)7 d后，分別測量青霉、白霉在平板中的直徑。
1．6酵母生長抑制試驗
取啤酒酵母菌種進行復活，挑取活化后的釀酒酵母擴大培養(yǎng)，調(diào)節(jié)酵母菌體濃度為105—106個/mL并取180μL酵母發(fā)酵液與20μL桑黃水提物溶液均勻混合，置于Bioscreen10×10孔板，使樣品終濃度分別為4 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL，以無菌水作為空白對照，30℃連續(xù)震蕩，寬波長于600 nm吸光度，間隔20 min讀數(shù)，連續(xù)測定2 000 min。
1．7巴氏殺菌乳菌群總數(shù)的控制
將滅菌后的桑黃水提物與新鮮牛乳混合均勻，使樣品在牛乳中的終濃度為0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL，均質(zhì)后進行巴氏殺菌，置于10℃下保存，按國標“GB 47892—2010食品安全國家標準”方法測定牛乳中細菌總數(shù)，連續(xù)測定2周。
1．8有益菌的影響
抑菌方法參照ZHAO［14］并稍作改動。取桑黃水提物分別用無菌去離子水配制成1 mg/mL、10 mg/mL、50 mg/mL溶液，待用；取保加利亞乳桿菌（MRS培養(yǎng)基）、嗜熱鏈球菌（M17培養(yǎng)基）以及雙歧桿菌（MRS培養(yǎng)基）三種有益菌株復蘇擴大培養(yǎng)，其余步驟參照“1.3革蘭氏陰性菌抑制試驗”。
不同濃度的桑黃水提物對乳制品中有害指示菌的生長抑制作用（實驗儀器與方法）
不同濃度的桑黃水提物對乳制品中有害指示菌的生長抑制作用（實驗結果與結論）
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