摘要乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一種危害嚴(yán)重的人畜共患病毒,囊膜蛋白(envelope protein,E)對(duì)JEV的神經(jīng)毒力起關(guān)鍵作用。前期研究發(fā)現(xiàn),重組乙型腦炎病毒(recombinant Japanese encephalitis virus,rJEV)囊膜蛋白I176R位點(diǎn)突變可致弱其神經(jīng)毒力。為鑒定rJEV-EI176R位點(diǎn)突變后其生物學(xué)特性的變化,本研究克隆分析了E176位點(diǎn)突變重組病毒rJEV-EI176R的E基因序列和E蛋白的生物信息學(xué)特征;利用qPCR、蝕斑試驗(yàn)和間接免疫熒光(indirect immunofluorescence assay,IFA)等技術(shù)測(cè)定rJEV-EI176R的生長(zhǎng)曲線、對(duì)多種細(xì)胞的吸附差異和rJEV-EI176R誘導(dǎo)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系(mouse microglia cell line,BV-2)細(xì)胞炎性水平差異。結(jié)果顯示,rJEV-EI176R的E蛋白帶正電荷的殘基增加1個(gè),等電點(diǎn)升高0.37,不穩(wěn)定指數(shù)升高0.39;E蛋白的α螺旋、β折疊、延伸鏈以及無(wú)規(guī)則卷曲的數(shù)量及占比均發(fā)生了改變,同時(shí)E176位點(diǎn)氨基酸與附近氨基酸有了不同的連接;rJEV-EI176R在BV-2細(xì)胞上的生長(zhǎng)曲線沒有顯著變化且能夠感染不同來源的神經(jīng)細(xì)胞和腎細(xì)胞;rJEV-EI176R的吸附能力顯著提高(P<0.05)但蝕斑大小變化不顯著;rJEV-EI176R接種BV-2細(xì)胞后,在12和24 h均引起腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、干擾素γ誘導(dǎo)蛋白-10(interferon-gamma-induced protein-10,IP-10)的水平顯著低于親本株(P<0.05)。本研究豐富了JEV毒株E蛋白的生物學(xué)特性研究,為后期深入研究JEV減毒機(jī)制和疫苗研發(fā)提供基礎(chǔ)資料。
乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一種危害嚴(yán)重的人畜共患病原(Desingu et al.,2017;Lu et al.,2017)，可引起人類病毒性腦炎，嚴(yán)重危害人類健康，現(xiàn)已成為國(guó)際公共衛(wèi)生問題；同時(shí)，JEV可造成公豬(Sus scrofa)睪丸炎、懷孕母豬流產(chǎn)或弱胎和仔豬腦炎，威脅我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展(Jamgaonkar et al.,2003;曾小鳳,2013)。
JEV E蛋白在病毒結(jié)合和入侵宿主細(xì)胞中起著關(guān)鍵作用(Nain et al.,2016;Mukhopadhyay etal.,2005)，同時(shí)還含有血凝素與中和抗原決定簇，參與病毒的復(fù)制、細(xì)胞嗜性、致病性、適應(yīng)性等，且與誘導(dǎo)宿主的免疫性應(yīng)答關(guān)系密切(Mackenzieet al.,2004)。E蛋白上含有多種抗原表位，因此是病毒感染后誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)最關(guān)鍵的蛋白，能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體(Hurrel‐brink,McMinn,2003;Mukhopadhyay et al.,2005)。
目前已有大量證據(jù)表明，E蛋白的氨基酸殘基突變可導(dǎo)致JEV的神經(jīng)毒力致弱，如減毒菌株SA14-14-2、RP-2ms、CH2195LA和CJN-S1(Ni etal.,1994;Yu,2010;Chiou,Chen,2007;Ni,Barrett,1998;Wu,Lee,2001;Wu et al.,2003)。SA14-14-2弱毒株是其親本毒株SA14在細(xì)胞上傳代獲得，兩毒株E基因上存在8個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變(E107,E138,E176,E177,E264,E279,E315和E439)，Yang等(2017)研究明確了E107和E138位置的氨基酸是SA14-14-2神經(jīng)毒力致弱的關(guān)鍵決定因素。研究發(fā)現(xiàn)，E-244處的甘氨酸Gly-谷氨酸Glu突變足以賦予小鼠(Mus musculus)致命的神經(jīng)毒力，包括在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中病毒的迅速傳播和組織炎癥(Yun et al.,2014)。JEV的E138、E47位點(diǎn)的突變能夠使JEV毒株的毒力發(fā)生改變，并且酸性突變?cè)鰪?qiáng)神經(jīng)毒力，堿性突變減弱神經(jīng)毒力(Zheng et al.,2018)。在這些致弱的突變株中，同樣包含E蛋白176殘基，本課題組前期通過反向遺傳平臺(tái)成功包裝、拯救了重組親本株病毒rSA14和重組突變株病毒rJEV-EI176R，并已證明E蛋白I176R單點(diǎn)突變會(huì)致弱其神經(jīng)毒力(Zhouet al.,2018b;Zhou et al.,2018a)。因此，探究E蛋白I176R單點(diǎn)突變后的生物學(xué)特性對(duì)于闡釋病毒致弱機(jī)制和疫苗開發(fā)具有重要意義。本研究擬通過基因克隆和生物信息學(xué)軟件對(duì)E基因的序列進(jìn)行比對(duì)和生物信息學(xué)分析，以多種細(xì)胞為研究對(duì)象，通過比較突變毒株rJEV-EI176R的生長(zhǎng)特性、吸附差異和誘導(dǎo)細(xì)胞因子的水平差異等研究，以期闡釋E蛋白I176R單點(diǎn)突變后的生物學(xué)特性，為后期深入研究JEV減毒機(jī)制和疫苗研發(fā)提供基礎(chǔ)資料。
乙腦病毒株囊膜蛋白I176R位點(diǎn)在BV-2細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性差異——摘要、前言
乙腦病毒株囊膜蛋白I176R位點(diǎn)在BV-2細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性差異——材料與方法
乙腦病毒株囊膜蛋白I176R位點(diǎn)在BV-2細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性差異——結(jié)果與分析
乙腦病毒株囊膜蛋白I176R位點(diǎn)在BV-2細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性差異——討論、結(jié)論
相關(guān)新聞推薦
1、生長(zhǎng)曲線分析儀應(yīng)用：海洋絲狀真菌蜂窩平板培養(yǎng)與碳源生長(zhǎng)曲線測(cè)量
2、明永冰川地區(qū)低溫黃桿菌噬菌體生長(zhǎng)曲線繪制及生物學(xué)特性（二）
3、肉豆蔻揮發(fā)油：枯草桿菌、大腸桿菌、黃曲霉等5種細(xì)菌生長(zhǎng)曲線圖繪制