3討論
E蛋白大小約為50 kD，主要由β鏈組成，在晶格中組裝成反向平行的二聚體。成熟的病毒體上排列有90個(gè)E蛋白二聚體。E蛋白具有3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，中央結(jié)構(gòu)域Ⅰ由九鏈混合的β-桶組成，結(jié)構(gòu)域Ⅱ主要由β鏈組成，而結(jié)構(gòu)域Ⅲ形成免疫球蛋白樣折疊結(jié)構(gòu)(Liu et al.,2015)。E蛋白是JEV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，同時(shí)E蛋白上有多個(gè)抗原表位，能夠參與病毒感染后誘發(fā)的免疫反應(yīng)。本研究測序發(fā)現(xiàn)，JEV rSA14和rJEV-EI176R的E蛋白確實(shí)存在176位點(diǎn)I-R的突變，分別對JEV rSA14和rJEV?EI176R的氨基酸基本序列特征分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白有500個(gè)氨基酸，同時(shí)發(fā)現(xiàn)I-R突變是脂肪族中性氨基酸到堿性氨基酸的突變。Zheng等(2018)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)E蛋白中某些氨基酸突變?yōu)閴A性氨基酸時(shí)，會導(dǎo)致毒株的毒力降低。
本研究發(fā)現(xiàn)，E176位點(diǎn)I-R的突變導(dǎo)致E蛋白等電點(diǎn)上升，推測是因?yàn)椴《驹隗w外傳代的過程中會發(fā)生正電荷突變，從而使病毒更能適應(yīng)體外培養(yǎng)。E蛋白的Pymol分析顯示，I-R的突變導(dǎo)致了176位點(diǎn)氫鍵結(jié)合的變化，蛋白質(zhì)內(nèi)部氫鍵的變化可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)以及功能的變化。研究表明，JEV關(guān)鍵毒力位點(diǎn)上E138氨基酸的變化會導(dǎo)致與E47氨基酸的氫鍵連接變化，而突變E47位氨基酸同樣也會引起毒力的改變。本研究發(fā)現(xiàn)，位點(diǎn)突變后的病毒E蛋白二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋、β-折疊、延伸鏈以及無規(guī)則卷曲的數(shù)量及占比均發(fā)生了改變，這些改變可改變E蛋白的空間結(jié)構(gòu)，同時(shí)，蛋白質(zhì)的功能作用取決于其空間結(jié)構(gòu)，揭示位點(diǎn)突變后E蛋白的結(jié)構(gòu)變化有助于闡釋病毒的減毒機(jī)制。
以上都是基于預(yù)測進(jìn)行的結(jié)構(gòu)分析，對于E蛋白176位點(diǎn)I-R的突變會導(dǎo)致病毒毒力減弱的機(jī)制提供部分理論基礎(chǔ)。E176的單一I-R突變減弱了JEV的神經(jīng)毒力，該突變病毒株rJEV-EI176R與親本病毒株rSA14在BV-2細(xì)胞中具有相似的生長特性，在BV-2細(xì)胞、U-251細(xì)胞、Vero細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞上均觀察到綠色熒光，顯示了突變病毒對于不同細(xì)胞的適應(yīng)性。在BV-2細(xì)胞中，rJEV-EI176R病毒對細(xì)胞的附著度增加，這意味著細(xì)胞在生物活動(dòng)中有更多的機(jī)制來改變病毒的數(shù)量。探究病毒突變前后的生長特性有助于揭示病毒在機(jī)體中復(fù)雜的減毒機(jī)制。
在細(xì)胞因子的釋放過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞起到重要作用，小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)不同的模式識別受體以確認(rèn)病毒，病毒入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)之后會引起細(xì)胞因子和促炎癥因子的釋放(Nayak et al.,2014)。本研究發(fā)現(xiàn)，親本株rSA14病毒相較于突變株rJEV?EI176R病毒能夠引起B(yǎng)V-2細(xì)胞釋放更多的TNF-α、IL-6和IP-10，導(dǎo)致更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。TNF-α能作為促炎癥因子誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞因子及趨化因子，作用于神經(jīng)元引起損傷；此外活化的小膠質(zhì)細(xì)胞還能通過釋放谷氨酸鹽引起神經(jīng)毒性，而谷氨酸鹽的合成增多又與其釋放的TNF-α密切相關(guān)。
高水平的TNF-α能夠引起白細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入炎性反應(yīng)區(qū)，釋放降解酶和活性氧，清除病毒并造成組織損傷，且其分泌與病情嚴(yán)重程度相關(guān)(Jang et al.,2021)。高水平的IL-6可以促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，加重腦水腫(Tanaka et al.,2014)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生感染時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞開始活化并大量表達(dá)IP-10，介導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤，啟動(dòng)或促進(jìn)炎性反應(yīng)進(jìn)程(Qiao et al.,2022)。研究表明，JEV P3株病毒感染BV-2細(xì)胞能夠促進(jìn)TNF-α、IL-6、CCL-2炎性因子的表達(dá)和分泌，這些細(xì)胞因子的大量釋放使神經(jīng)元發(fā)生間接損傷，如TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、IP-10等，能引起腦部各區(qū)細(xì)胞不同程度的形態(tài)變化(蔣蓉等,2013)。小膠質(zhì)細(xì)胞活化早期對于機(jī)體有效地抵抗病毒入侵是有利的，但是隨著小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化，產(chǎn)生的過多炎性因子會導(dǎo)致炎癥發(fā)生，從而造成不可逆的炎癥損傷。
4結(jié)論
本研究通過序列分析和生物信息學(xué)方法測定了重組點(diǎn)突變r(jià)SA14和rJEV-EI176R病毒的E蛋白基因序列、二級結(jié)構(gòu)和176位點(diǎn)在突變前后的氫鍵連接變化，通過對E蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析，可以對E蛋白176位點(diǎn)I-R的突變所導(dǎo)致的病毒毒力減弱的機(jī)制提供部分理論基礎(chǔ)。同時(shí)，測定了重組點(diǎn)突變病毒rJEV-EI176R和親本株病毒rSA14的生長特性和誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)分泌的差異。本研究對比揭示了JEV SA14病毒E蛋白176位點(diǎn)I-R突變后的生物學(xué)特性變化，為深入探究E蛋白功能特征和深入闡釋該位點(diǎn)突變后的減毒機(jī)制及疫苗研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。
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