摘要：目的：優(yōu)化肝靶向肽~抗腫瘤肽（CSP-MDA-7/IL-24）在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)的相關(guān)條件。方法：通過考察CSP-MDA-7/IL-24重組菌生長曲線，選擇合適的誘導(dǎo)時機(jī)，通過SDS-PAGE檢測CSP-MDA-7/IL-24蛋白的表達(dá)量，單因素分析誘導(dǎo)時間、培養(yǎng)基pH值、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑IPTG濃度，在此基礎(chǔ)上各選取5個水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，摸索最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。結(jié)果：培養(yǎng)基pH7.0、IPTG濃度0.12 mmol/L、培養(yǎng)溫度42℃、誘導(dǎo)表達(dá)4h為重組蛋白的最佳表達(dá)條件。結(jié)論：為進(jìn)一步制備重組蛋白CSP-MDA-7/IL-24及評價(jià)其生物活性奠定了基礎(chǔ)。
肝靶向肽CSP I-plus是從瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白（circumsprozoite protein，CSP）中篩選得到的能夠特異識別并黏附在肝細(xì)胞表面的多肽序列。肝靶向肽能與肝細(xì)胞表面受體硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）特異性結(jié)合，將具有藥物活性的物質(zhì)富集于肝臟部位，發(fā)揮其生物學(xué)功能。黑色素瘤分化相關(guān)基因7（melanoma differentiation-associated gene-7，MDA-7）是Fisher等于1995年發(fā)現(xiàn)的具有細(xì)胞因子樣特性的腫瘤抑制基因，其編碼的蛋白具有廣譜抗腫瘤活性，有強(qiáng)大的“腫瘤特異性旁觀者效應(yīng)”，可對周圍甚至遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，對控制腫瘤復(fù)發(fā)具有重要的臨床意義，但對正常細(xì)胞無任何毒性。后來發(fā)現(xiàn)MDA-7與白細(xì)胞介素10（IL-10）細(xì)胞因子家族基因具有同源性和親緣關(guān)系，屬于IL-10家族，因此，2001年被重新命名為白細(xì)胞介素24（IL-24）。研究表明，MDA-7/IL-24在肝癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，其表達(dá)水平與腫瘤大小、病理分級和血清甲胎蛋白（AFP）呈明顯的負(fù)相關(guān)，且隨著肝癌惡性程度的增加表達(dá)水平減少或缺失。
基于肝靶向和抗腫瘤的雙重作用，本實(shí)驗(yàn)室利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了肝靶向肽-抗腫瘤肽（CSP-MDA-7/IL-24）融合基因，期望用于肝癌術(shù)后治療，減少術(shù)后復(fù)發(fā)率和提高生存率。如何獲得大量重組蛋白CSP-MDA-7/IL-24以滿足其開發(fā)應(yīng)用和研究須進(jìn)一步探索。我們對誘導(dǎo)時間、培養(yǎng)基pH值、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑IPTG濃度各選取5個水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，對重組蛋白進(jìn)行條件優(yōu)化，為重組蛋白CSP-MDA-7/IL-24的規(guī)模化生產(chǎn)和活性評價(jià)奠定了基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
重組大腸桿菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24由廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌表達(dá)載體pET21b及大腸桿菌BL21由本實(shí)驗(yàn)室保存。丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、TEMED（BioRad公司）；酵母提取物、胰蛋白胨（Oxoid公司）；異丙基-β-D-硫代半糖（IPTG）（Sigma公司）；氨芐青霉素（Amp）（Amresco公司）；蛋白預(yù)染marker（Fermentas公司）。
1.2重組大腸桿菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24的構(gòu)建
將CSP-MDA-7/IL-24融合基因的PCR產(chǎn)物純化后，分別用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切重組克隆載體CSP-MDA-7/IL-24和質(zhì)粒表達(dá)載體pET21b，用T4DNA連接酶將克隆載體雙酶切得到的小片段與質(zhì)粒pET21b連接構(gòu)建重組表達(dá)載體pET21b-CSP-MDA-7/IL-24，經(jīng)鑒定為陽性后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，轉(zhuǎn)化菌種涂于含Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫箱培養(yǎng)16～18 h，獲得重組大腸桿菌BL21/pET21b-CSP-MDA-7/IL-24。
1.3生長曲線測定
接菌環(huán)取一環(huán)重組菌株BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24甘油種子劃在LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)過夜，按體積比1∶100接入LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，此時開始計(jì)時，分別在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8和9 h各取1 mL菌液測定D600nm值，以時間為橫坐標(biāo)、D600nm值為縱坐標(biāo)，繪制表達(dá)菌株BL21/pET21b-CSPMDA-7/IL-24的生長曲線，以研究其生長規(guī)律，確定最佳誘導(dǎo)時機(jī)。
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