2結(jié)果與討論
2.1富集聚球藻的主要類群
流式細胞分析結(jié)果顯示，富集樣品主要為富含PC的聚球藻(圖1)。高通量測序共測得269 977條序列，在97%的相似度下，共獲得295個OTUs，其中OTU183為優(yōu)勢度最高的類群。系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，富集聚球藻以5.1亞類的cladeⅧ型為主，相似序列均分離自近海海域的浮游生物樣本。
圖1富集樣本B12和H19的流式細胞熒光信號圖以及系統(tǒng)進化樹
注:*表示該OTU在樣品中的相對豐度。B12和H19分別為采集于2020年8月渤海B12(38.87°N，119.67°E)和黃海H19(33.00°N，124.01°E)站位的聚球藻富集樣本
聚球藻作為中國近海浮游植物的主要類群，種群多樣性豐富，按系統(tǒng)發(fā)育組成可分為Subcluster 5.1、5.2和5.3三個大的亞類，包含至少20多個分支，按捕光色素蛋白組成可分為富含PC型和富含PE型的聚球藻。結(jié)果顯示，聚球藻富集樣本B12和H19樣品間種群結(jié)構(gòu)差異不明顯，原位聚球藻經(jīng)富集培養(yǎng)后種群趨于單一化。富含PE的聚球藻在硝酸鹽濃度較高的環(huán)境中處于競爭劣勢，因此在培養(yǎng)過程中其相對豐度降低，PC型聚球藻成為主要類群。聚球藻系統(tǒng)進化分析歸類的cladeⅧ型是隸屬于Subcluster 5.1的一類富含PC的聚球藻，對鹽度和營養(yǎng)鹽變化有較高的適應性，在河口區(qū)域的相對豐度遠高于外海。
2.2不同硝酸鹽濃度對聚球藻生長的影響
富集培養(yǎng)的聚球藻接種至改良的SNAX培養(yǎng)基中，聚球藻無適應期，快速進入對數(shù)生長期，且比生長速率迅速達到最大值(圖2)。對數(shù)生長期時，不同硝酸鹽濃度實驗組間的聚球藻細胞生物量差異不大;對數(shù)生長期后，聚球藻細胞密度隨硝酸鹽濃度的增高而逐漸增高。當硝酸鹽濃度為0.1、1.0、10.0μmol·L–1時，聚球藻培養(yǎng)體系所能支持的生物量較小且差異不顯著。聚球藻細胞在對數(shù)生長期達到一定豐度后，細胞豐度不再增長，最高細胞密度為4.49×106 cells·mL–1。當硝酸鹽濃度為100.0μmol·L–1時，聚球藻培養(yǎng)體系可支持的生物量更大，聚球藻細胞可持續(xù)增長直至穩(wěn)定，最高細胞密度為1.35×107 cells·mL–1。不同硝酸鹽濃度下，B12和H19聚球藻的生長特性存在差異，B12的對數(shù)生長期持續(xù)時間均少于H19。
圖2不同硝酸鹽濃度下聚球藻細胞密度以及最大比生長速率
注:B12和H19分別為采集于2020年8月渤海B12(38.87°N，119.67°E)和黃海H19(33.00°N，124.01°E)站位的聚球藻富集樣本。標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異
高硝酸鹽濃度可以支持的聚球藻生物量更大。在藻類生長初期，硝酸鹽并不會成為藻類生長的限制因子;隨著聚球藻的生長，硝酸鹽濃度為0.1、1.0、10.0μmol·L–1的實驗組氮源不足，藻細胞通過內(nèi)源呼吸維持自身代謝和光合作用，藻細胞生長受到限制;而100.0μmol·L–1硝酸鹽可提供給聚球藻細胞更多的營養(yǎng)，從而細胞不斷增殖，達到穩(wěn)定。實驗采用了半連續(xù)培養(yǎng)方式，聚球藻細胞未呈現(xiàn)明顯的衰亡期。聚球藻對不同硝酸鹽濃度具有較強的適應性，但不同硝酸鹽濃度組間生長狀況存在較大差異，這主要是由其對硝酸鹽吸收能力的不同引起。已有研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，聚球藻在較高硝酸鹽濃度下，生長會出現(xiàn)延遲效應，硝酸鹽濃度由5μmol·L–1升高至156μmol·L–1時，其半飽和常數(shù)由較低水平(0.1~8μmol·L–1)提高至較高水平(1~156μmol·L–1)。聚球藻對硝酸鹽濃度變化的迅速適應，可促使其在硝酸鹽濃度波動較大的近海環(huán)境中細胞穩(wěn)定增殖，獲得相較于原綠球藻的競爭優(yōu)勢。
2.3不同硝酸鹽濃度對聚球藻色素含量的影響
隨著硝酸鹽濃度的增高，聚球藻的Chl a濃度逐漸增高，藻膽蛋白含量無明顯變化(圖3)。以第15 d聚球藻藻細胞數(shù)計算單位細胞內(nèi)的Chl a和藻膽蛋白含量，發(fā)現(xiàn)硝酸鹽濃度升高對單位藻細胞內(nèi)的Chl a累積無明顯影響，但藻膽蛋白含量降低。當硝酸鹽濃度為100.0μmol·L–1時，單位細胞內(nèi)PC、PE和APC的含量最低，分別為0.779 pg·cell–1、1.002 pg·cell–1、0.726 pg·cell–1。同一硝酸鹽濃度下，H19的Chl a含量顯著高于B12(P<0.05)。在1.0μmol·L–1硝酸鹽濃度下，B12樣本的藻膽蛋白含量低于檢出限。
圖3不同硝酸鹽濃度下聚球藻總?cè)~綠素a、藻膽蛋白的濃度
注:B12和H19分別為采集于2020年8月渤海B12(38.87°N，119.67°E)和黃海H19(33.00°N，124.01°E)站位的聚球藻富集樣本。標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異
Chl a作為一種光合色素，在光合作用中起到捕獲光能的作用，能有效吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化光能，驅(qū)動有機碳轉(zhuǎn)化為無機碳，是光能轉(zhuǎn)化效率的重要表征參數(shù)。硝酸鹽主要是利用光合作用中的H2O氧化形成O2的過程中釋放的ATP進入細胞。隨著硝酸鹽濃度的增加，光能轉(zhuǎn)化效率逐漸提高，光合作用增強，從而產(chǎn)生更多的ATP，促使更多的硝酸鹽主動輸入細胞，形成一種正反饋機制，有助于聚球藻將更多的光能轉(zhuǎn)化為自身化學能，從而提高其初級生產(chǎn)力。除了Chl a，聚球藻還可利用藻膽體捕獲和傳遞光能。氮是聚球藻藻膽蛋白的重要組成元素，直接影響藻膽體的合成。有研究表明，微藻主要通過調(diào)配用于氮固定和色素合成的能量，平衡氮缺乏的不利影響。高硝酸鹽濃度下，聚球藻細胞密度較大，用于氮固定的能量較多，而用于藻膽蛋白合成的能量較少。這也是不同硝酸鹽濃度下藻膽蛋白含量差異不大的主要原因。另外高硝酸鹽濃度下，聚球藻細胞密度變大的同時，細胞間的遮光效應增強，單位細胞的捕光能力受到一定抑制。
2.4不同硝酸鹽濃度對聚球藻光合生理參數(shù)的影響
不同硝酸鹽濃度對B12和H19的Fv/Fm的影響不同。B12各組間的Fv/Fm無顯著差異(P>0.05)，而H19的Fv/Fm隨硝酸鹽濃度的增大而逐漸減小(P<0.05)(圖4)。當硝酸鹽濃度為100.0μmol·L–1時，H19的Fv/Fm值與濃度為0.1μmol·L–1時相比，減少了43.27%，表明在高硝酸鹽濃度的環(huán)境中，聚球藻H19所捕獲的光能超過自身可利用的能力，光合作用受到的脅迫增大。不同濃度的硝酸鹽對兩種聚球藻富集樣本的Qy影響不顯著。
圖4不同硝酸鹽濃度下聚球藻的光合生理參數(shù)
注:B12和H19分別為采集于2020年8月渤海B12(38.87°N，119.67°E)和黃海H19(33.00°N，124.01°E)站位的聚球藻富集樣本。標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異
Fv/Fm和Qy分別表示PSII的最大光化學效率和熒光量子產(chǎn)率，能夠反映環(huán)境條件對藻細胞光合作用的脅迫。一般認為，硝酸鹽可以通過其中間產(chǎn)物亞硝酸鹽抑制植物光合作用。高濃度硝酸鹽下，細胞膜內(nèi)的質(zhì)子通透性通常高于細胞膜兩側(cè)的質(zhì)子梯度，從而導致光合作用所受到的脅迫增大。Sahay等和Chen等發(fā)現(xiàn)高亞硝酸鹽濃度可抑制光合作用中心的電子傳遞速率和葉綠體產(chǎn)氧速率，使藻細胞的Fv/Fm值降低。
2.5不同硝酸鹽濃度下培養(yǎng)體系中的營養(yǎng)鹽及碳氮含量的變化
隨著培養(yǎng)條件中硝酸鹽濃度的增高，培養(yǎng)結(jié)束后H19的NO3-和PO43-的濃度逐漸降低(圖5)。同時，當硝酸鹽濃度為100.0μmol·L–1時，培養(yǎng)體系內(nèi)的TIC和TOC的濃度較低，分別為9.96 mg·L–1和7.08 mg·L–1，TN的濃度無顯著差異(P>0.05)(圖6)。以第15 d培養(yǎng)體系中聚球藻藻細胞數(shù)計算單位細胞釋放的TIC、TOC和TN含量，分別為0.68 mg·cell–1、0.48 mg·cell–1和1.55 mg·cell–1。結(jié)果表明隨著硝酸鹽濃度的增高，藻體利用氮和磷的生理反應會加快，對氮和磷的同化率會略有升高，導致其培養(yǎng)體系中測得的氮和磷營養(yǎng)鹽濃度較低。雖然高硝酸鹽濃度能夠促進聚球藻對氮和磷的轉(zhuǎn)化速率，但是培養(yǎng)體系中的總有機碳含量并沒有顯著提高，聚球藻生物量的增加主要提高了食物鏈的底層供給，對于溶解有機碳的輸出影響較小。在實際海域，固碳并不等于儲碳，有機物的過量可能導致大量細菌滋生，從而將浮游植物固定的有機碳再次釋放入大氣中，同時消耗大量氧氣，使生態(tài)系統(tǒng)進入惡性循環(huán)。因此，適當?shù)臓I養(yǎng)鹽濃度將有助于避免富營養(yǎng)化并促進浮游植物生長，提高生物泵效率從而保持較高的儲碳能力。
圖5不同硝酸鹽濃度下聚球藻培養(yǎng)體系中NH4+、NO3–、NO2–和PO43–濃度
注:B12和H19分別為采集于2020年8月渤海B12(38.87°N，119.67°E)和黃海H19(33.00°N，124.01°E)站位的聚球藻富集樣本。標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異
圖6不同硝酸鹽濃度下聚球藻培養(yǎng)體系中的TIC、TOC和TN濃度
注:B12和H19分別為采集于2020年8月渤海B12(38.87°N，119.67°E)和黃海H19(33.00°N，124.01°E)站位的聚球藻富集樣本。標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異
氮是影響微藻生長的重要因素。過低的氮濃度會影響微藻細胞的三羧酸循環(huán)及葉綠素合成，降低其光合效率，而過高的氮濃度會導致微藻細胞中毒，生長受到抑制。已有研究表明，氮添加可促進浮游植物凈生長率的增加，但PSII光合作用參數(shù)Fv/Fm和σPSII與氮添加并無直接關(guān)系;氮缺乏條件下微藻生理水平上的響應與光照過量相似，會發(fā)生光合色素降解光合能力下降的現(xiàn)象，而代謝水平上合成胞外聚合物的能力會增強進而影響藻際環(huán)境微生物的豐度。硝酸鹽的同化主要依靠活性的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白(NRT)，硝酸還原酶(NR)和亞硝酸鹽還原酶(NiR)。其中，NRT主要負責將硝酸鹽輸送入細胞，NR和NiR促進硝酸鹽還原為銨。當硝酸鹽濃度較高時，NRT、NR和NiR基因的表達量較高，從而促進硝酸鹽的同化。聚球藻在全球海洋中數(shù)量巨大、分布廣泛且周轉(zhuǎn)迅速(相當于海洋中浮游植物的五倍)，是海洋異養(yǎng)生物的主要食物來源之一，同時也為異養(yǎng)細菌提供了重要碳源和營養(yǎng)源。高濃度的硝酸鹽可促進海洋中的聚球藻增殖，提升氮磷同化速率，提高底營養(yǎng)級的供給。但本研究也存在一定的局限性。富集樣品的聚球藻種群趨于同質(zhì)化，與實際海域原位聚球藻有差異，主要原因是富集培養(yǎng)條件過于單一，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)鹽濃度較高，導致聚球藻中的機會類群迅速適應成為絕對優(yōu)勢種。B12和H19以rpoC1為標記的種群組成差異不大，優(yōu)勢種均為OTU183，但實驗結(jié)果中兩者對硝酸鹽的響應在生長特性、光合參數(shù)方面存在較大的差異，主要由聚球藻在原海域生態(tài)位中水平轉(zhuǎn)移造成的適應性基因的轉(zhuǎn)入引起。另外培養(yǎng)實驗的“瓶頸效應”也會影響浮游植物響應特征。在30 mL至4 L的容積范圍內(nèi)，培養(yǎng)瓶容積對浮游植物生長有顯著影響。采用圍隔開展原位培養(yǎng)實驗將有助于進一步探究不同硝酸鹽濃度對聚球藻種群的影響。
3結(jié)論
通過研究不同硝酸鹽濃度下聚球藻的生長趨勢、光合色素含量、光合生理參數(shù)以及培養(yǎng)體系中碳氮含量的變化，發(fā)現(xiàn)聚球藻對硝酸鹽濃度具有較高的適應能力。聚球藻在不同硝酸鹽濃度下均能實現(xiàn)生長，當硝酸鹽濃度較高時，聚球藻培養(yǎng)體系可支持的生物量顯著提高，且對光能的轉(zhuǎn)化效率更高，光合作用更強。光合作用產(chǎn)生的能量促進了聚球藻對硝酸鹽以及碳、磷等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，但其捕獲的光能超過自身可利用的能力，導致其光合效率降低。研究結(jié)果證實高硝酸鹽濃度能夠促進聚球藻將更多的光能固定為自身化學能，提高氮、磷在海洋食物鏈的吸收轉(zhuǎn)化，然而其產(chǎn)生增量的效率較低，對浮游生態(tài)系統(tǒng)的儲碳促進作用相對較小。
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