導讀
本研究旨在尋找能夠在不利環(huán)境中促進小球藻(Chlorella)生長的微藻促生菌(microalgae-promoting bacteria,MGPB)。從4種小球藻中分離出50株共生細菌，并通過16S rRNA基因序列進行鑒定。功能篩選和二元培養(yǎng)實驗將這些菌株中的43株列為MGPB。在不利環(huán)境條件下(缺鐵、高鹽度或不適宜的海水環(huán)境)觀察到，MGPB處理的微藻的生長參數(shù)顯著高于未接種對照，并且Dinoroseobacter shibae是最有效的菌株。以取自不同海域海水(S-海水和Q-海水)（均去除微藻并添加營養(yǎng)鹽）為培養(yǎng)基，無菌小球藻在Q-海水中生長旺盛，但不能在交替單胞菌屬(Alteromonas)和弧菌屬(Vibrio)相對豐富的S-海水中生長。然而，當向S-海水中加入250μL/L的D.shibae時(OD600=0.1)，小球藻則能旺盛生長。小球藻在接種D.shibae后的S-海水和Q-海水中的生長速率沒有顯著差異(P>；0.05)，但均顯著低于(P<；0.05)Q-海水。16S rRNA基因分析顯示，在添加了D.shibae的Q-海水和S-海水中生長的微藻出現(xiàn)了相似的藻際細菌群落，表現(xiàn)為招募了更多的紅桿菌科(Rhodobacteriaceae)微生物（例如Ruegeria sp.），更少的假單胞菌科(Pseudomonadaceae)微生物（例如Pseudomonas sp.）。這些結果表明，添加共生MGPB可以改變藻際細菌群落。在脅迫條件下接種MGPB對小球藻的生長有一定的促進作用，但在適宜的環(huán)境下可能無效。這些結果也表明，分離出的MGPBs，特別是D.shibae，可以開發(fā)為一種生物接種劑，用于在不利環(huán)境中初步建立小球藻群落。
實驗設計
結果與討論
1、微藻和細菌分離
將單藻種培養(yǎng)的小球藻Chlorella sp.HN11在液體和瓊脂抗生素培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)至少5代，獲得無菌小球藻株(AHN11)。從4株小球藻中分離出50個可培養(yǎng)的共生細菌菌落，隸屬于4門33屬(包括7個未知種)(圖1)。分離到的細菌80%屬于變形菌門(Proteobacteria)，共有27屬40種；12%屬于厚壁菌門(Firmicutes)，有4屬6種；6%屬于放線菌門(Actinomycetes)，有1屬3種；2%隸屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)，有1屬1種。
細菌功能結果顯示(表1)，有9株溶磷菌、2株溶鉀菌、12株產鐵載體細菌、33株固氮細菌、14株產ACC脫氨酶細菌和4株產IAA細菌。部分菌株具有多種功能，證明了有益細菌在微藻培養(yǎng)中的重要性。
圖1.Sankey圖顯示了本研究中分離的50種海洋細菌基于其16S rDNA序列的關系。
表1.分離的細菌及其篩選出的功能。
2、共生細菌和無菌小球藻的二元培
2.1、正常培養(yǎng)條件下
微藻表現(xiàn)出的生物現(xiàn)象與其伴生細菌密不可分。二元培養(yǎng)144 h后，結果表明，分離出的共生細菌中有86%(50株中有43株)對小球藻有積極的促生作用(圖2)，可歸類為微藻促生菌（MGPB）。其中，D.shibae對小球藻的促生作用最好，而H.meridiana、M.aquimarina、P.flexa、M.populi、Mesorhizobium sp.、B.bullata和M.salsuginis對小球藻的生長無促進作用。所有分離出的共生細菌均顯著提高了(P<；0.1)小球藻的最大熒光量子產率(Fv/Fm)(圖2B)，這意味著盡管共生細菌中有部分未表現(xiàn)出促生作用，但對小球藻光合是有益的。
圖2.AHN11與共生細菌的二元培養(yǎng)。(A)通過細胞密度變化計算的相對生長率。(B)96小時微藻Fv/Fm。橫坐標表示添加菌株；CK是無菌微藻培養(yǎng)物。處理組和對照組在第192小時的生長速率差異：無差異(ns)，P<；0.05(*)，P<；0.01(**)。
2.2、在缺鐵條件下
鐵是光合作用和呼吸作用的重要元素。本研究分離的12株產鐵載體細菌分別與AHN11在缺鐵培養(yǎng)基中共培養(yǎng)(圖3)，同時，以一株不產生鐵載體的MGPB菌株R.porphyridii作為對照。由于鐵的限制，AHN11的生長速率和Fv/Fm均受到抑制。當AHN11與MGPB共培養(yǎng)時，12株產鐵載體細菌中有6株能夠促進微藻在缺鐵培養(yǎng)基中的生長(P<；0.5)，且添加D.shibea能使微藻獲得最高的生長速率和Fv/Fm。盡管B.vestrisii、H.meridiana、B.altitudinis、A.tumefaciens、D.tsuruhatensis和B.massiliensis都具有鐵載體活性，但它們在缺鐵條件下對微藻生長沒有影響。不產生鐵載體的MGPB菌株R.porphyridii在這種缺鐵條件下對微藻生長也沒有促進作用。因此，并非所有產鐵載體的細菌都能在缺鐵時促進微藻生長，這可能與細菌釋放鐵載體的類型或含量不同有關。
圖3.AHN11與假定產鐵載體細菌在缺鐵培養(yǎng)基中的二元培養(yǎng)物。(A)通過細胞密度變化計算的相對生長率。(B)第96小時測定的微藻Fv/Fm。與實驗對照組進行比較的差異：無差異(ns)，P<；0.5(*)，P<；0.1(**)，P<；0.01(**)。
2.3、在高鹽條件下
從分離的細菌中隨機選取6株MGPBs，與無菌小球藻AHN11在高鹽培養(yǎng)基中進行二元培養(yǎng)。隨著鹽度的增加，純培養(yǎng)物的生長速率降低，而與細菌共培養(yǎng)時生長速率提高(圖4)。除P.stutzeri外，與鹽度為30時相比，MGPB對微藻生長的促進作用在鹽度為45時增強，在鹽度為60時減弱。當微藻與P.stutzeri共培養(yǎng)時，與鹽度為30時相比，鹽度為45時生長促進效應減弱，鹽度為60時生長促進效應增強，這表明在較高鹽度下，P.stutzeri提高微藻耐鹽性的能力最強。P.stutzeri是一種常見的植物促生細菌(PGPB)，廣泛應用于改善植物在遞增鹽度梯度下的生長。而在微藻中，影響其鹽度適應的驅動因素是微藻-細菌相互作用，即特定微生物的存在改變了微藻的鹽適應性，這可能歸因于細菌分泌的耐鹽酶。在所有鹽度下，所有二元培養(yǎng)液的Fv/Fm均極顯著高于AHN11單培養(yǎng)液(P<；0.1)(圖4B)，進一步證明了MGPB能夠緩解小球藻的鹽脅迫。
在上述所有條件下，D.shibea對微藻的生長促進作用最好。D.shibea是玫瑰桿菌分支的一員，最初從鞭毛藻中分離出來，并已被證明是一種普遍存在的海洋微藻共生體。研究發(fā)現(xiàn)，D.shibea可以分泌多種外生代謝物，包括B族維生素前體和生長因子，這可能有利于微藻的生長。此外，代謝組學分析顯示，當與D.shibea共培養(yǎng)時，假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)細胞中的多種氨基酸、脂肪酸和C4糖的表達均有上調。本研究已經證實D.shibea具有鐵載體、ACC脫氨酶活性和固氮作用，有助于微藻利用不溶性鐵、N2和降解ACC(乙烯的前體)，從而促進微藻生長。56631669418228138
圖4.不同鹽度下的AHN11。(A)通過細胞密度變化計算的相對生長率。(B)第96小時微藻Fv/Fm。與對照組相比的差異：P<；0.5(*)，P<；0.1(**)，P<；0.01(**)。
3、MPGB與無菌小球藻在天然海水中的共培養(yǎng)
3.1、MPGB對小球藻生長的影響
使用兩種天然海水(S和Q)配制寧波3號培養(yǎng)基。培養(yǎng)96 h后，微藻細胞密度差異顯著（圖5）。AHN11在S-海水(S)、無菌S-海水(S-)、添加混合細菌的S-海水(S+M)或無菌Q-海水(Q-)中幾乎不生長。環(huán)境中的細菌可能是影響微藻生長的主要因素，因為無機養(yǎng)分在這些培養(yǎng)基中是充足的，非生物環(huán)境因素（如pH和鹽度）也是有利的。只有當D.shibae被添加到S-海水(S+D)中時，無菌小球藻才能像在添加了D.shibae的Q-海水(Q+D)中一樣生長旺盛。小球藻在未滅菌的Q-海水(Q)中生長最好。然而，當添加D.shibae(Q+D)或混合細菌(Q+M)時，微藻細胞密度與未滅菌的Q-海水(Q)相比有所下降，但其Fv/Fm無統(tǒng)計學差異(P>；0.5)(圖5)。結果表明，在微生物組成對微藻不利的環(huán)境中，添加有益細菌可以促進微藻的生長，但在有利的環(huán)境下可能無效。
圖5.AHN11在S或Q海水培養(yǎng)基中的生長。(A)微藻的生長。(B)微藻的Fv/Fm。S-&Q-：高壓滅菌寧波3號S-或Q-海水。S&Q：寧波3號S-或Q-海水。S+D&Q+D：接種ANH11和D.shibae的寧波3號S-或Q-海水。S+M&Q+M：接種ANH11和混合細菌的寧波3號S-或Q-海水。與對照組相比，在實驗結束時標記差異：P<；0.5(*)，P<；0.1(**)，P<；0.01(**)。
3.2、添加MPGB對小球藻藻際微生物的影響
為了證實上述假設，通過高通量測序進一步分析了處理之間的細菌群落組成。五個樣品共獲得1,071,093個16S rRNA基因序列，去除低質量序列后，每個樣品平均獲得63,202個reads，并用于后續(xù)分析。共獲得細菌操作分類單元（OTUs）3639個，注釋為518個屬，注釋率為85.47%。
3.3、海水和藻際微生物組的多樣性
Chao1和Shannon指數(shù)分別表示樣品中OTU的數(shù)量和群落多樣性。如圖6A所示，Q-海水(QA)或添加了D.shibae的Q-海水(QAD)中藻際細菌的多樣性均顯著高于Q-海水中原生細菌的多樣性(Q)。在添加了D.shibae的S-海水(SAD)中，藻際微生物的多樣性顯著低于Q-海水中原生細菌的多樣性(Q)，但與S-海水中原生細菌的多樣性(S)差異不顯著。而在S-海水中，由于生物量低，無法檢測到藻際微生物。這表明小球藻在Q-海水中可以招募更多的藻際微生物，而在添加有D.shibae的S-海水中可能只招募有利于其生長的微生物。PCoA反映了樣本間的群落組成關系，距離越近，樣本間的群落組成越相似(圖6B)。在三種環(huán)境(QA、QAD和SAD)中，藻際微生物組成是聚集的。這表明，雖然SAD中的藻際微生物多樣性較低，但物種組成與QA和QAD相似，盡管LEfSe(線性判別分析效應大小)和Venn圖顯示了它們之間的差異(圖6C)。
LEfSe(圖6C左)揭示了在豐度上存在顯著差異的物種，Venn圖(圖6C右)總結了共有或特有物種之間的聯(lián)系。在QAD和QA中發(fā)現(xiàn)了較為豐富的優(yōu)勢種(如QA中的Bacteroides和Roseivvirga，以及QAD中的Parasegetibacter和Lewinella)，這表明微藻促生菌D.shibae的添加在改變藻際微生物的原始平衡中發(fā)揮了關鍵作用。
圖6.細菌組成差異。(A)α-多樣性。(B)β-多樣性。(C)海洋樣本中的共有物種和特有物種。S&Q：S-或Q-海水中的細菌組成。QA：寧波3號Q-海水中培養(yǎng)的藻際細菌組成。SAD&QAD：在添加有D.shibae的寧波3號S-或Q-海水中培養(yǎng)的藻際細菌組成。
3.4、海水和藻際微生物組的組成
變形菌門（Proteobacteria）是所有五個樣本中的優(yōu)勢門，占OTU序列總數(shù)的87.17%±3.41%。與海水原生菌群相比，藻際積累了更多的α-變形菌(Alpha-Proteobacteria)，而γ-變形菌(Gamma-Proteobacteria)的相對豐度降低(圖7A)。在更高的分類學水平上(科或屬水平)，組成細菌分類群的相對貢獻因樣品而異(圖7B，C)。然而，優(yōu)勢細菌分類群的組成也有明顯的相似性。魯杰氏菌屬(Ruegeria)在兩種海水中的相對豐度較低，但在藻際中富集。相比之下，在海水中相對豐度較高的交替單胞菌屬(Alteromonas)、弧菌屬(Vibrio)和Corallomonas是藻際中的稀有類群。這表明微藻能夠選擇性地招募特定菌群，并抑制弧菌科(Vibrionaceae)等病原菌的生長。正如Mars Brisbin等人的研究顯示，細菌和微藻之間存在特定的有益相互作用，這些相互作用由確定性的群落組裝穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)組裝而成。Nitrincolaceae和紅桿菌科(Rhodobacteraceae)是Q海水中的優(yōu)勢細菌，相對豐度分別為35.98%和18.69%。其中隸屬于Nitrincolaceae的Corallomonas sp.相對豐度最高，為30.74%。在QA中，Rhodobacteraceae和假單胞菌科(Pseudomonadaceae)在藻際中的相對豐度顯著增加。假單胞菌屬(Pseudomonas)的相對豐度達到25.91%，而屬于Rhodobacteraceae的Ruegeria相對豐度達到13.08%。據(jù)報道，紅桿菌對浮游植物有益，其相對豐度與葉綠素A濃度呈正相關，這可以解釋其在藻際中的富集現(xiàn)象。假單胞菌是常見的植物促生長細菌(PGPB)，對微藻的生長也有促進作用。S-海水中的原生菌群由以Alteromonas和Vibrio為代表的交替單胞菌科(Alteromonadaceae)和弧菌科(Vibrionaceae)構成。Alteromonas是一種常見的微藻致死細菌，可分泌微藻細胞裂解液(β-葡萄糖苷酶)，并通過碳輸入實現(xiàn)快速生長。Vibrio可以利用微藻分泌的內源性色氨酸合成并分泌熒光素，進而合成IAA，破壞微藻細胞膜，加速微藻細胞裂解。這可能是小球藻在這種海水培養(yǎng)基中難以生長的原因。
圖7.細菌組成。(A)綱水平上樣本OTU的分布。(B)科水平上樣本OTU的分布。(C)屬水平上樣本OTU的分布。(D)屬水平上樣本細菌群落組成。S&Q：S-或Q-海水中的細菌組成。QA：寧波3號Q-海水中培養(yǎng)的藻際細菌組成。SAD&QAD：在添加有D.shibae的寧波3號S-或Q-海水中培養(yǎng)的藻際細菌組成。
3.5、細菌分類群與D.shibae添加之間的關聯(lián)
在寧波Q-海水培養(yǎng)物中接入少量的D.shibae后，微藻生長下降(圖5)。在QAD中，Rhodobacteraceae的相對豐度增加，Ruegeria的相對豐度達到21.41%，而Pseudomonadaceae的相對豐度下降。這可能歸因于群體感應(QS)和群體淬滅機制，它們破壞了藻際微生物的平衡，影響了微藻的生長。D.shibae和Ruegeria是玫瑰桿菌分支的成員，釋放與玫瑰桿菌鞭毛形成和運動相關的?；呓z氨酸內酯QS。它可以防止玫瑰桿菌在擁擠和潛在有限的微環(huán)境中聚集，并促進其在宿主中更均勻的定殖。我們推測，D.shibae的加入將導致培養(yǎng)物中QS的含量增加，并促進更多Ruegeria和D.shibae定殖(圖7C)。玫瑰桿菌分支成員也被發(fā)現(xiàn)通過產生抑制性化合物和采用擴散性殺傷機制來抑制或殺死其競爭對手，這也可能是由QS誘導的。研究發(fā)現(xiàn)Ruegeria可殺死Vibrio，并對Pseudomonas有一定的抑制作用。這可能是藻際中Pseudomonas減少的原因。此外，細菌的引入還引起了其他變化，例如在QA中發(fā)現(xiàn)了Kiloniellaceae，但在QAD中沒有。熱圖聚類分析(圖7D)顯示，QAD的微生物組成與SAD更相似(QAD和SAD首先聚在一起，然后與QA聚在一起)。Rhodobacteraceae在藻際中顯著富集，相對豐度從S-海水中的11.04%增加到55.61%(其中Ruegeria占34.4%)，而Pseudomonadaceae的相對豐度略低，從S-海水中的2.47%增加到9.75%(其中Pseudomonas占9.03%)。相比之下，海水富集的有害細菌Alteromonadaceae和Vibrionaceae的相對豐度從S-海水藻際中的50.17%下降到1.2%(其中Alteromonas占1.18%)和1.41%(其中Vibrio占1.41%)?？赡苡捎贒.shibae釋放的QS，有益細菌在藻際的定殖增加，同時環(huán)境中的有害細菌受到抑制，這使得小球藻能夠在S-海水環(huán)境中生長。Ly等人的實驗觀察到了類似的結果，其中有益細菌減輕了環(huán)境強光對微藻的脅迫。本研究表明，添加MGPBs可以通過改變藻際微生物組促進小球藻在不利環(huán)境中的生長。目前對MGPBs的研究主要集中在微藻生物量和代謝物生產，以及收獲和凈化方面，而MGPB對藻際微生物組成的影響尚未見報道。以往關于藻際微生物組的研究主要集中在有害細菌上。例如，添加具有殺藻活性的有害細菌會降低藻際微生物的多樣性，使更多添加的有害細菌和更少的Rhodobacteraceae在藻際中定殖，導致微藻大量裂解死亡。這些結果表明，引入D.shibae可以改變藻際微生物的組成。
結論
利用細菌來促進微藻的生長和代謝是一種很有前景的生物技術應用方法。本實驗從4種小球藻中分離出50株共生細菌，其中86%為微藻促生菌(MGPB)。MGPB對微藻的生長有一定影響，可以提高微藻的抗逆性。此外，還獲得了一株高效MGPB菌株D.shibae。接種D.shibae可以改變小球藻藻際微生物組的組成，使其招募更多的Rhodobacteraceae和更少的Pseudomonadaceae。這一方法能在不利微生物環(huán)境中促進小球藻的生長，但在有利環(huán)境中則會降低小球藻的生長。本研究為MGPB在不利環(huán)境中促進建立微藻群落補充了新的應用。