纖維素物質(zhì)是地球上含量最豐富的碳水化合物，而目前人類對纖維素的開發(fā)與利用還非常有限，因此如何更有效地開發(fā)和利用纖維素資源已成為當今世界的熱門課題之一。目前，對纖維素的降解利用主要是用酸堿處理等化學手段，以及汽爆及蒸汽加熱等物理手段。生物法由于對設備要求低，分解后的產(chǎn)物易回收利用，以及對環(huán)境污染較小等特點而備受重視。纖維素是一個復雜酶系，根據(jù)其功能的不同可分為3類：作用于纖維素非結(jié)晶區(qū)的內(nèi)切葡聚糖酶（CMC）；作用于無定型區(qū)切割糖苷鍵的外切葡聚糖酶（FP）；以及作用于纖維二糖的β-葡萄糖苷酶（BG）。協(xié)同作用才能將結(jié)構(gòu)復雜的天然纖維降解。纖維素酶在食品、洗滌、紡織、飼料、造紙等方面具有廣泛的應用和發(fā)展前景。通過對本實驗室保存的67株菌株進行初篩和復篩，A25這一株菌株是本次實驗所篩選的，具有較高降解纖維素活力的菌株，本文對其纖維素酶的生產(chǎn)培養(yǎng)特性進行研究，對于了解其降解機制以及實際應用都有重要意義。
DNS法標準曲線的制備
稱0.05g經(jīng)105℃烘干至恒重的葡萄糖溶于少量蒸餾水中，用蒸餾水定溶至500mL配制成濃度為50μg/mL的葡萄糖溶液。取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL和1.2mL葡萄糖溶液再加入蒸餾水將體積配制至10mL。再分別從中取2mL，再加蒸餾水1.0mL再加DNS試劑2.0mL搖勻，置于沸水中煮沸5min，取出置與冷水中冷卻到室溫，測其OD530值。根據(jù)OD值，以葡萄糖濃度為縱坐標，吸光值為橫坐標，列出直線回歸方程（Y=aX+b）。
葡萄糖標準曲線的繪制
參照1.2.1所描述的方法制備出標準葡萄糖曲線（圖1），根據(jù)標準葡萄糖曲線求出直線回歸方程y=0.003 4x-0.505，R2=0.996 8（y：葡萄糖濃度，x：OD530的值），通過直線回歸方程可以計算纖維素酶酶促反應中產(chǎn)生葡萄糖的濃度，從而根據(jù)酶活力單位定義算出酶活。
高產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩
纖維素在纖維素酶的作用下水解成纖維二糖和葡萄糖，水解后的糖類與剛果紅染料形成紅色沉淀，使產(chǎn)酶菌株的菌落周圍出現(xiàn)清晰的紅色水解圈，根據(jù)水解圈的大小可粗略的估計菌株產(chǎn)酶的情況，然后選取透明圈較大的菌株進行接種。剛果紅是對纖維素酶進行初步篩選的試驗方法，實驗方法比較簡單。通過它可以使纖維素固體培養(yǎng)基上的菌種的代謝產(chǎn)物形成淺紅色水解透明圈。用剛果紅染液覆蓋培養(yǎng)皿一層靜止染色30min，纖維素酶菌株產(chǎn)纖維素酶越多，產(chǎn)生的紅色水解透明圈越大，產(chǎn)纖維素酶速度越快，淺紅色水解透明圈出現(xiàn)的越早。雖然水解透明圈H/C的比值大小直接反映了酶活水平的高低，但不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力，不能定量說明該菌株產(chǎn)纖維素酶的能力。也有研究表明液體樣品的酶濃度與透明圈的直徑（下轉(zhuǎn)127頁）（上接24頁）成線性關系，可以對酶活進行初步定量。
高產(chǎn)纖維素酶菌株的復篩
已知纖維素酶的作用方式：CO酶是使天然纖維素晶體分鏈，起一個分離和水合作用，從而使天然纖維素裂解成為直鏈纖維素；而C0酶雖不能水解天然纖維素，但能水解直鏈纖維素的β-l，4-葡萄糖苷鍵生成纖維二糖，纖維二糖再經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解成為葡萄糖。前人研究認為，纖維素的降解關鍵是濾紙酶活的高低，再結(jié)合β-葡萄糖苷酶活，而CMC酶活只作參考。通過對7個菌株發(fā)酵液的濾紙酶活、CMC酶活、β-葡萄糖苷酶活進行測定，初步篩選出產(chǎn)纖維素酶活力較高的A25菌株。初步試驗表明，在50℃反應時間30min，pH5.5時A25菌株產(chǎn)生的纖維素酶的活性有較大提高。建議對A25進行進一步的優(yōu)化試驗，以探明其最適的產(chǎn)酶條件，或?qū)ζ溥M行進一步的誘變，以提高其酶活性應用于生產(chǎn)實踐。
溫度對纖維素酶活性的影響
從粗酶液中吸粗酶液2mL和2mL DNS和1mL蒸餾水加入試管中，在不同的水浴溫度下水浴處理30min后，對菌體的產(chǎn)酶量進行檢測。為了確定酶活的最適溫度，通過測40～80℃不同溫度下的實驗確定酶活，不同培養(yǎng)溫度對纖維素酶有不同的影響，結(jié)果表明，曲霉A25水浴處理在40℃時酶活力表現(xiàn)較低，50℃時酶活力達到最大值，水浴處理溫度超出50℃時酶活力逐漸變小。對于纖維素酶活的最適溫度為50℃，即纖維素酶產(chǎn)量的最適溫度在50℃。
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