豬鏈球菌(Streptococcussuis)可引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、肺炎和突然死亡，嚴(yán)重危害著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。根據(jù)莢膜多糖抗原的差異，可將其分為35個(gè)血清型，即1～34及1/2型。對(duì)豬致病性較強(qiáng)的有豬鏈球菌1型、2型、7型和9型，尤其是豬鏈球菌2型，不僅對(duì)豬的致病性最強(qiáng)，而且可感染特定人群并致死，是一種重要的人畜共患病病原菌。本試驗(yàn)從我國(guó)部分豬場(chǎng)分離出1株2型豬鏈球菌，鑒定菌株7種毒力因子基因，并用分離菌株進(jìn)行了小鼠致病性試驗(yàn)，以期為豬鏈球菌2型疫苗的研究提供必要條件和有利數(shù)據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1病料來(lái)源2014-2016年從全國(guó)部分豬場(chǎng)采集疑似豬鏈球菌感染病例腦樣品，腦組織有明顯的肉眼可見(jiàn)出血，共20份。
1.1.2豬鏈球菌培養(yǎng)基TSA(Tryptic Soy Agar)、TSB(Tryptic Soy Broth)培養(yǎng)基購(gòu)自BD生物科技有限公司。
1.1.3主要試劑新生牛血清購(gòu)自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司；革蘭氏染液購(gòu)自南京建成科技有限公司；引物合成及基因測(cè)序由擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。
1.1.4細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。
1.1.5試驗(yàn)動(dòng)物18～22 g的昆明鼠，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
1.2方法
1.2.1細(xì)菌分離將采集的20份腦樣品，分別于無(wú)菌操作臺(tái)中使用接種環(huán)挑取部分組織，均勻涂劃在加有5%新生牛血清的TSA平板中，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。24 h后于無(wú)菌條件下挑取平板上的疑似菌落劃線接種于5%新生牛血清的TSA平板上，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌形態(tài)。
1.2.2 PCR鑒定
1.2.2.1 DNA提取用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，-20℃以下保存?zhèn)溆谩?
1.2.2.2 PCR引物選取豬鏈球菌屬保守基因gdh(谷氨酸脫氫酶)，血清型特異性基因cas2J(莢膜多糖)以及7種主要毒力因子fbps(纖連蛋白原結(jié)合蛋白)、sly(溶血素)、orf2(毒力相關(guān)因子)、mrp(溶菌酶釋放蛋白)、89k(毒力島)、gapdh(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)和epf(胞外因子)基因，參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。
表1豬鏈球菌引物
1.2.2.3 PCR檢測(cè)及測(cè)序分析PCR擴(kuò)增體系：10×buffer 5.0μL，dNTP(2.5 mmol/L)4.0μL，引物P1(10μmol/L)1.0μL，引物P2(10μmol/L)1.0μL，模板DNA 2.0μL，Taq酶(5 U/μL)0.25μL，加注射用水至50μL；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳。用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將該P(yáng)CR產(chǎn)物連接pMD18-T載體，送擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，并與BLAST上的相關(guān)序列比較分析。
1.2.3形態(tài)觀察按常規(guī)方法對(duì)分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征。
1.2.4生長(zhǎng)曲線的測(cè)定分離菌株接種TSB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)8～10 h作為種子液。再將上述種子液按培養(yǎng)基總體積的2%接種TSB培養(yǎng)基，于37℃搖床170 r/min振蕩培養(yǎng)。其間每隔2 h取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，監(jiān)測(cè)24 h。
1.2.5小鼠致病性試驗(yàn)采用半數(shù)致死量(LD50)評(píng)價(jià)分離菌的致病性，取30只雄性昆明小鼠，隨機(jī)分為6組，每組5只，其中5組作為攻毒組，一組作為對(duì)照組。濃縮菌液，調(diào)整菌液初始濃度為1.0×1010CFU/mL，進(jìn)行10倍倍比稀釋，選取100～10-45個(gè)梯度，每個(gè)梯度攻毒一組小鼠，腹腔注射菌液0.2 mL，對(duì)照組腹腔注射0.2 mL生理鹽水。連續(xù)觀察14 d，記錄各組死亡情況，對(duì)死亡小鼠立即解剖，觀察病變情況，進(jìn)行各臟器細(xì)菌分離、鑒定。根據(jù)Reed-Muench累加法計(jì)算分離菌株的LD50。
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