建立了仔豬副傷寒活疫苗生產(chǎn)用菌株生長曲線，獲取菌株培養(yǎng)參數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)合成培養(yǎng)基初步應(yīng)用。將豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)運(yùn)用試管和三角瓶分別靜置和振蕩培養(yǎng)30 h，期間取4、8、12、18、24、30 h等6個(gè)點(diǎn)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)并建立生長曲線，確定37℃靜置培養(yǎng)18～24 h，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)8～24 h為培養(yǎng)穩(wěn)定期。不同接菌量比較結(jié)果表明，37℃靜置培養(yǎng)24 h，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h均可達(dá)到菌體穩(wěn)定期。在穩(wěn)定期參數(shù)條件下，比較合成培養(yǎng)基與常規(guī)普通肉湯培養(yǎng)基對(duì)該菌的增殖效果，結(jié)果表明，37℃靜置培養(yǎng)24 h,試管及三角瓶培養(yǎng)菌數(shù)分別為27×108～31×108、33×108～41×108CFU/mL；37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，試管及三角瓶培養(yǎng)菌數(shù)分別為58×108～66×108、78×108～88×108CFU/mL。而同條件3批普通肉湯培養(yǎng)菌數(shù)均低于合成培養(yǎng)基，且批次間穩(wěn)定性較合成培養(yǎng)基差。將合成培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12 h的菌液接種小鼠均10/10存活；免疫后攻毒家兔達(dá)4/5～5/5保護(hù)，與普通肉湯基本一致。合成培養(yǎng)基保存期試驗(yàn)表明，25℃避光保存28 d與當(dāng)天配制的液體合成培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)菌數(shù)基本一致。獲取的培養(yǎng)參數(shù)適合用于合成培養(yǎng)基的初步評(píng)價(jià)，研制的合成培養(yǎng)基培養(yǎng)菌數(shù)優(yōu)于普通肉湯，且不影響菌體安全性及免疫原性，室溫保存期可達(dá)28 d。
接種仔豬副傷寒活疫苗(C500株)是預(yù)防和控制豬霍亂沙門氏菌病的有效途徑[1-2]。但制苗用菌液生產(chǎn)一直采用的是普通肉湯，其主要成分牛肉湯易受動(dòng)物的種類、年齡、肉源的新鮮度及消化程度的影響，造成疫苗批次間的質(zhì)量不穩(wěn)定[3-4]。而合成培養(yǎng)基由于其成分相對(duì)確定且質(zhì)量穩(wěn)定，是解決培養(yǎng)批次間穩(wěn)定性差的關(guān)鍵，并逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[4]。不過，如何實(shí)現(xiàn)大量合成培養(yǎng)基的篩選研制是廣大科研工作者面臨的難題。通過建立仔豬副傷寒活疫苗生產(chǎn)用菌株生長曲線，了解該菌株的生長規(guī)律，選擇其對(duì)數(shù)生長末期或穩(wěn)定期的培養(yǎng)參數(shù)和培養(yǎng)菌數(shù)作為參考，通過在同培養(yǎng)條件下，篩選較高培養(yǎng)菌數(shù)的培養(yǎng)基是實(shí)現(xiàn)合成培養(yǎng)基研制的重要途徑之一[5]。
對(duì)于小型實(shí)驗(yàn)室和獸用生物制品企業(yè)，試管和三角瓶是日常最常用的培養(yǎng)器具。而靜置培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)，因其操作簡便、需要儀器設(shè)備簡單，廣泛用于生產(chǎn)用種子液制備及科學(xué)研究中大規(guī)模發(fā)酵工藝生產(chǎn)的前期小試。一直以來，我國現(xiàn)行獸用生物制品規(guī)程(2000版)(以下簡稱《規(guī)程》[3])雖規(guī)定仔豬副傷寒制苗用生產(chǎn)種子采用37℃靜置培養(yǎng)24 h，但缺少完整的培養(yǎng)參數(shù)。而對(duì)于三角瓶振蕩培養(yǎng)(也稱搖瓶發(fā)酵培養(yǎng))，因其體積小，培養(yǎng)基需求量小，模擬了發(fā)酵培養(yǎng)的換氣頻率和溶氧環(huán)境，雖已廣泛用于實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)基篩選、大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)前的小試，但對(duì)于仔豬副傷寒活疫苗生產(chǎn)用菌株的培養(yǎng)參數(shù)的幾無報(bào)道，這為日常菌液培養(yǎng)凍干、基因組及質(zhì)料提取、新型合成培養(yǎng)基篩選研究帶來困難。
本研究運(yùn)用試管及三角瓶進(jìn)行豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)系統(tǒng)的靜置和振蕩培養(yǎng)試驗(yàn)，確定了該菌的生長曲線，通過選擇菌數(shù)穩(wěn)定期的培養(yǎng)參數(shù)條件，從而實(shí)現(xiàn)在同條件下對(duì)研制的合成培養(yǎng)基進(jìn)行初步應(yīng)用評(píng)價(jià)，為開展細(xì)菌合成培養(yǎng)基的研究提供經(jīng)驗(yàn)方法和借鑒思路。
1材料
1.1菌種生產(chǎn)用菌種為豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)(2006.8.29凍干，0.3 mL/支)；檢驗(yàn)用菌種為豬霍亂沙門氏菌(CVCC79102株)(2006.8.29凍干，0.3 mL/支)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。
1.2試劑及耗材仔豬副傷寒活疫苗合成培養(yǎng)基(批號(hào)為200701、200702、200703)，由北京中海生物科技有限公司配制及提供。其主要成分：胰酪蛋白胨(批號(hào)VM732731-644)，購自MERCK公司；酵母浸粉(批號(hào)911948)購自O(shè)XOID公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、葡萄糖等均為分析純化學(xué)試劑，購自北京化學(xué)試劑公司。
普通肉湯(批號(hào)為20070130、20070115、20070122及20070205)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察培養(yǎng)基組配制和供應(yīng)。
A型試管，規(guī)格：25 mL；三角瓶，規(guī)格：500 mL,由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察培養(yǎng)基組購自北京化工玻璃廠。
1.3儀器37℃恒溫培養(yǎng)箱及HZL-250恒溫雙層振蕩培養(yǎng)箱，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。
1.4動(dòng)物小鼠：ICR系，30～35日齡、體重18～22 g，清潔級(jí)；大耳白兔：體重1.5～2.0 kg，普通級(jí)；由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組采購并提供。
2方法
2.1種子液制備按《規(guī)程》[3]方法進(jìn)行。
2.2生長曲線的建立
2.2.1靜置培養(yǎng)將普通肉湯分別分裝于6支25 mL A型試管(分裝10 mL/管)和1瓶500 mL三角瓶(分裝200 mL/瓶)，按2%接入種子液，37℃靜置培養(yǎng)30 h，期間分別于4、8、12、18、24、30 h取出1管樣品及從三角瓶中取樣5 mL，按現(xiàn)行《中國獸藥典》[6]方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。
2.2.2振蕩培養(yǎng)普通肉湯按2.2.1項(xiàng)方法分裝，按2%接入種子液，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)30 h，期間分別于4、8、12、18、24、30 h取出1管樣品及從三角瓶中取樣5 mL，按現(xiàn)行《中國獸藥典》[6]方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。
2.2.3不同接種菌數(shù)的比較研究種子液按《規(guī)程》[3]制備500 mL，以3500 r/min離心20 min，棄上清，菌泥用60 mL的滅菌生理鹽水懸浮，然后分別稀釋成每4 mL含20×108、40×108、80×108、160×108、320×108CFU活菌。
將普通肉湯按200 mL/瓶分裝10瓶500 mL三角瓶，2%接入種子液(每瓶4 mL)，接入菌數(shù)分別為20×108、40×108、80×108、160×108、320×108CFU，其中5瓶37℃靜置培養(yǎng)24 h，另5瓶置37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，期間分別取37℃靜置培養(yǎng)18、24 h，37℃振蕩培養(yǎng)8、12 h樣品各5 mL，按現(xiàn)行《中國獸藥典》[6]方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。
2.3合成培養(yǎng)基的初步應(yīng)用
2.3.1研制的合成培養(yǎng)基與常規(guī)培養(yǎng)基的比較
2.3.1.1培養(yǎng)菌數(shù)運(yùn)用已建立的仔豬副傷寒活疫苗生產(chǎn)用菌株培養(yǎng)參數(shù)，制備3批合成培養(yǎng)基(批號(hào)分別為200701、200702及200703)與3批普通肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)分別為20070115、20070122及20070205)，各分裝于A型試管(10 mL/管)和500 mL三角瓶(200 mL/瓶)中。按2.2項(xiàng)建立的培養(yǎng)參數(shù)，按2%加入種子液，37℃靜置培養(yǎng)24 h和37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，分別取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。
2.3.1.2培養(yǎng)菌體的安全性及免疫原性將三角瓶中每批合成培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液，3500 r/min離心20 min，棄上清，菌體沉淀用適量生理鹽水懸浮后，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。分別皮下注射體重18～22 g的小鼠10只，0.2 mL/只(含1×108CFU活菌)，觀察21 d，記錄存活情況；肌肉注射體重1.5～2.0 kg的家兔5只，1.0 mL/只(含25×108CFU活菌)，30 d后，連同條件相同的不免疫對(duì)照家兔5只，各皮下注射經(jīng)肉肝胃(膜)消化湯培養(yǎng)2代的豬霍亂沙門氏菌(CVCC79102株)1.0 mL(含3 MLD的活菌)，觀察30 d，記錄存活情況。2.3.2合成培養(yǎng)基保存期將3批合成培養(yǎng)基分別按說明書用注射用水配制成5000 mL溶液，116℃滅菌30 min，置室溫(25℃)避光保存0、7、14、21、28 d。然后分裝于滅菌的500 mL三角瓶中(培養(yǎng)基裝量200 mL)，各按2%加入種子液，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)8、10、12 h，分別取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。
3結(jié)果與分析
3.1靜置及振蕩培養(yǎng)結(jié)果見表1。從表1看出，靜置培養(yǎng)，A管與三角瓶菌數(shù)變化趨勢(shì)一致，18～24 h可達(dá)到菌數(shù)穩(wěn)定期；振蕩培養(yǎng)，A管與三角瓶菌數(shù)變化趨勢(shì)基本一致，8～12 h可達(dá)到菌數(shù)穩(wěn)定期。
表1豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果(單位：×108CFU/mL)
注：種子液活菌計(jì)數(shù)為8.3×108CFU/mL。
3.2不同接種菌數(shù)的比較從表2看出，接入菌數(shù)多，其培養(yǎng)到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)間提前，而接入菌數(shù)少，其培養(yǎng)到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)間慢，但37℃靜置培養(yǎng)24 h、37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h均各自達(dá)到菌數(shù)穩(wěn)定期。
表2不同接種菌數(shù)豬霍亂沙門氏菌(CVCC79500株)培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果(單位：×108CFU/mL)
3.3合成培養(yǎng)基與普通肉湯的比較試驗(yàn)結(jié)果見表3、表4。從表3結(jié)果看出，在相同培養(yǎng)條件下，3批合成培養(yǎng)基的培養(yǎng)菌數(shù)均較3批普通肉湯的培養(yǎng)菌數(shù)高。從表4結(jié)果看出，合成培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體對(duì)小鼠安全，均10/10健活；免疫效果與普通肉湯結(jié)果基本一致，免疫兔達(dá)4/5～5/5保護(hù)，對(duì)照5/5死亡。
表3培養(yǎng)基比較試驗(yàn)結(jié)果(單位：×108CFU/mL)
200701批與20070115批接入活菌計(jì)數(shù)為9.2×108CFU/mL種子液、200702批與20070122批接入活菌計(jì)數(shù)為11×108CFU/mL種子液、200703批與20070205批接入活菌計(jì)數(shù)為11×108CFU/mL種子液
表4培養(yǎng)菌體安全及免疫原性試驗(yàn)結(jié)果
注：因《規(guī)程》[3]中無“效力檢驗(yàn)”方法，“效力試驗(yàn)”參考《規(guī)程》[3]中“免疫原性試驗(yàn)”進(jìn)行。
3.4保存期結(jié)果從表5顯示，合成培養(yǎng)基室溫(25℃)保存28 d的培養(yǎng)菌數(shù)與保存當(dāng)日基本一致。
表5培養(yǎng)基不同保存期活菌計(jì)數(shù)結(jié)果(單位：×108CFU/mL)
注：200701批接種菌液為11.3×108CFU/mL;200702批接種菌液為10.1×108CFU/mL；200703批接種菌液為9.5×108CFU/mL
4小結(jié)與討論
細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中生長繁殖，可分為遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期[2]。通常需要選擇對(duì)數(shù)生長末期或穩(wěn)定期的細(xì)菌，用于進(jìn)一步的冷凍、提取基因組、培養(yǎng)基篩選等試驗(yàn)[4,7]。靜置與振蕩培養(yǎng)是常規(guī)試驗(yàn)的兩種培養(yǎng)方法，但因?yàn)檎袷幣囵B(yǎng)的溶氧和換氣頻率遠(yuǎn)高于靜置培養(yǎng)，因而兩者培養(yǎng)所達(dá)到的細(xì)菌含量以及到達(dá)穩(wěn)定期的時(shí)間不同,從而能從表1中得出靜置和振蕩培養(yǎng)菌數(shù)差異大。
運(yùn)用試管及三角瓶以靜置和振蕩培養(yǎng)建立的生長曲線，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基只要按容器體積的標(biāo)準(zhǔn)盛裝量(體積的1/3～1/2)，在培養(yǎng)主要參數(shù)一致的情況下，如振蕩培養(yǎng)時(shí)試管與三角瓶均采用透氣塞、均垂直置于搖床中，并采用同樣的溫度、轉(zhuǎn)速、接菌比例、培養(yǎng)時(shí)間，其培養(yǎng)趨勢(shì)基本一致。但由于容器及內(nèi)部空間體積不一樣，三角瓶溶氧含量高于試管，因而三角瓶培養(yǎng)菌數(shù)高于試管。而對(duì)于靜置培養(yǎng)，試管與三角瓶均采用透氣塞，溫度及接菌比例一致，其培養(yǎng)趨勢(shì)基本一致，而且培養(yǎng)菌數(shù)與容器無關(guān)，僅與培養(yǎng)方式有關(guān)。
不同接菌量的種子液比較試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接入菌數(shù)多，培養(yǎng)到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)間提前，而接入菌數(shù)少，到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)間慢。按照表2中設(shè)計(jì)的接菌量，如果按靜置培養(yǎng)20×108CFU/mL計(jì)，則20×108～320×108CFU/mL相對(duì)于含200 mL培養(yǎng)基的三角瓶中接菌量達(dá)0.5%～8%。由于我國獸用生物制品種子液一般都采用靜置培養(yǎng)，因而表2接入菌數(shù)所占比例完全能覆蓋獸用生物制品種子液常用的1%～3%接菌量[3]，表明按此標(biāo)準(zhǔn)的接菌量對(duì)整個(gè)振蕩培養(yǎng)中培養(yǎng)菌數(shù)影響不大。
由生長曲線獲得的細(xì)菌培養(yǎng)參數(shù)，在此參數(shù)下可得出研制的合成培養(yǎng)基批次間相對(duì)穩(wěn)定，培養(yǎng)菌數(shù)優(yōu)于普通肉湯。由于牛肉湯難以質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化，因此3批普通肉湯培養(yǎng)菌數(shù)差異大[3-4]。同時(shí)運(yùn)用合成培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體對(duì)小鼠的安全檢驗(yàn)及對(duì)家兔的免疫攻毒結(jié)果與普通肉湯一致，符合《規(guī)程》[3]中“仔豬副傷寒活疫苗制造及檢驗(yàn)規(guī)程”的要求。另外合成培養(yǎng)基保存28 d，其培養(yǎng)菌數(shù)與當(dāng)天新配制培養(yǎng)基一致。因此，初步試驗(yàn)表明，研制的合成培養(yǎng)基質(zhì)量穩(wěn)定，培養(yǎng)菌數(shù)高，而且不改變菌體的安全性及免疫原性，可替代普通肉湯。當(dāng)然，合成培養(yǎng)基在發(fā)酵生產(chǎn)中的實(shí)用性有待進(jìn)一步研究。
本文采用實(shí)驗(yàn)室最常用的培養(yǎng)器具(試管和三角瓶)，首次系統(tǒng)建立了靜置和振蕩培養(yǎng)仔豬副傷寒活疫苗生產(chǎn)用菌株的生長曲線。明確了37℃靜置培養(yǎng)24 h或37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，可獲得培養(yǎng)菌體穩(wěn)定期。在此參數(shù)下，初步完成了培養(yǎng)基的比較篩選和應(yīng)用評(píng)價(jià)。上述工作的完成，為我國獸用細(xì)菌類疫苗合成培養(yǎng)基的篩選研究提供了經(jīng)驗(yàn)借鑒，從而進(jìn)一步為實(shí)現(xiàn)獸用細(xì)菌類疫苗高密度培養(yǎng)工藝化改造奠定基礎(chǔ)。
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