豬多殺性巴氏桿菌病(豬肺疫)是由豬多殺性巴氏桿菌引起的一種常見(jiàn)的細(xì)菌性傳染病。多年來(lái)，EO630株被廣泛用作豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗及其聯(lián)苗的生產(chǎn)菌株，EO630株是用豬源B型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)毒菌株經(jīng)在含有海鷗牌洗衣粉的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代選育而得[1]。利用多殺性巴氏桿菌EO630株生產(chǎn)的弱毒活疫苗對(duì)豬肺疫有較好的預(yù)防效果。根據(jù)傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝，采用逐步增大通氣量培養(yǎng)15 h，測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)EO630株在培養(yǎng)的第10～11小時(shí)時(shí)活菌數(shù)達(dá)到高峰期，活菌數(shù)大約在6.8×109CFU/mL。為了提高抗原活菌數(shù)，采用分段補(bǔ)料法進(jìn)行EO630株抗原的生產(chǎn)試驗(yàn)，即在培養(yǎng)的第8小時(shí)和第10小時(shí)分別添加10%的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)15 h后收獲，并測(cè)定細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。從該生長(zhǎng)曲線中能看出，在培養(yǎng)第12～13小時(shí)時(shí)，EO630株的活菌數(shù)達(dá)到高峰期，最高活菌數(shù)可達(dá)1.31×1010CFU/mL。按分段補(bǔ)料法共生產(chǎn)抗原5批，培養(yǎng)12 h后收獲抗原，平均活菌數(shù)為1.17×1010CFU/mL，凍干后的平均存活率為69%。按《中華人民共和國(guó)獸藥典2010版三部(簡(jiǎn)稱《獸藥典》)[2]進(jìn)行安全和效力檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果均符合《藥典》規(guī)定，達(dá)到預(yù)期效果。
本次傳統(tǒng)工藝發(fā)酵培養(yǎng)的試驗(yàn)共進(jìn)行4次重復(fù)，根據(jù)各個(gè)時(shí)段的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果取平均數(shù)，最終確定該傳統(tǒng)工藝發(fā)酵培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線。
分段補(bǔ)料法發(fā)酵培養(yǎng)細(xì)菌發(fā)酵罐培養(yǎng)基量為10萬(wàn)毫升，接種細(xì)菌種子液2000 mL。接種完畢后，37℃靜止培養(yǎng)1 h，然后通入潔凈空氣，以逐漸增大通氣量的方法進(jìn)行培養(yǎng)。通氣量根據(jù)溶氧量來(lái)設(shè)置調(diào)整，2～3 h小氣量通氣培養(yǎng)，溶氧量設(shè)置在50%，在通氣培養(yǎng)第4～6小時(shí)時(shí)，逐步增大氣量，溶氧量設(shè)置為60%～100%(即培養(yǎng)第4小時(shí)溶氧量設(shè)置為60%，培養(yǎng)第5小時(shí)溶氧量調(diào)整到80%，培養(yǎng)第6小時(shí)溶氧量調(diào)整到100%)。培養(yǎng)至6 h后，全部按氣量通氣培養(yǎng)，溶氧量設(shè)定為100%來(lái)進(jìn)行通氣培養(yǎng)，待培養(yǎng)至第15小時(shí)時(shí)培養(yǎng)結(jié)束。在通氣培養(yǎng)第8小時(shí)和第10小時(shí)，分別添加10%經(jīng)滅菌的新鮮培養(yǎng)基(即分別添加1萬(wàn)毫升、1.1萬(wàn)毫升經(jīng)滅菌的新鮮培養(yǎng)基)。從第4小時(shí)開(kāi)始，每小時(shí)取樣并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，測(cè)定EO630株的生長(zhǎng)曲線。
本次分段補(bǔ)料法的試驗(yàn)共進(jìn)行4次重復(fù)，根據(jù)各個(gè)時(shí)段的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果取平均數(shù)，最終確定該分段補(bǔ)料法發(fā)酵培養(yǎng)的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。
分段補(bǔ)料法制備抗原、疫苗通過(guò)用分段補(bǔ)料法和傳統(tǒng)工藝分別發(fā)酵培養(yǎng)4批進(jìn)行比較，摸索分段補(bǔ)料的發(fā)酵工藝。按2.3.3項(xiàng)的方法測(cè)定的生長(zhǎng)曲線可以看出，在培養(yǎng)至第12～13小時(shí)時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最高峰。
根據(jù)摸索的分段補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)工藝共制備了5批EO630株抗原，選擇在培養(yǎng)第12小時(shí)時(shí)即結(jié)束培養(yǎng)時(shí)收獲抗原，并取樣分別進(jìn)行純粹檢驗(yàn)和活菌計(jì)數(shù)，按《規(guī)程》中規(guī)定的方法進(jìn)行配苗、凍干。
質(zhì)量檢驗(yàn)
對(duì)每批疫苗在凍干前后分別隨機(jī)取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)疫苗的凍干存活率，并按《藥典》標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)疫苗進(jìn)行安全、效力等質(zhì)量檢驗(yàn)。
結(jié)果與分析
活菌計(jì)數(shù)結(jié)果用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝和分段補(bǔ)料法分別培養(yǎng)EO630株，每個(gè)時(shí)段的活菌計(jì)數(shù)見(jiàn)表1。
生長(zhǎng)曲線兩種方法培養(yǎng)EO630株所得生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1所示。
分段補(bǔ)料發(fā)酵工藝制備抗原的結(jié)果分段補(bǔ)料發(fā)酵工藝制備EO630株抗原見(jiàn)表2，培養(yǎng)至12 h收獲平均菌數(shù)為117億/mL。分段補(bǔ)料發(fā)酵工藝制備EO630株疫苗生產(chǎn)情況見(jiàn)表3，5批疫苗凍干后的平均存活率為69%，安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)均合格。
圖1生長(zhǎng)曲線
小結(jié)與討論
根據(jù)傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝制備EO630株抗原，在培養(yǎng)6～10 h時(shí)活菌數(shù)增長(zhǎng)很快，培養(yǎng)第10～11小時(shí)時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最高峰，之后活菌數(shù)逐步下降，活菌數(shù)平均為6.8×109CFU/mL。根據(jù)分段補(bǔ)料工藝制備EO630株抗原，在培養(yǎng)6～12 h時(shí)，活菌數(shù)都一直保持較快的生長(zhǎng)速度，在培養(yǎng)至12～13 h時(shí)，菌液的生長(zhǎng)達(dá)到菌高峰，之后繼續(xù)培養(yǎng)，活菌數(shù)呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)，活菌數(shù)平均為1.19×1010CFU/mL，與傳統(tǒng)發(fā)酵工藝相比，其活菌數(shù)有大幅度的增長(zhǎng)，增菌效果明顯。
采用分段補(bǔ)料工藝制備的5批EO630株抗原，在培養(yǎng)12 h時(shí)收獲抗原，菌液活菌數(shù)穩(wěn)定在1.08×1010～1.26×1010CFU/mL之間，菌液的平均活菌數(shù)為1.17×1010CFU/mL。該活菌數(shù)和測(cè)定生長(zhǎng)曲線時(shí)長(zhǎng)菌高峰期的菌數(shù)基本吻合，表明該工藝還是比較穩(wěn)定的。
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