大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)埃希氏菌屬(Escherichia)成員之一，一般不致病，多為條件致病菌。1894年，首次有了關(guān)于雞大腸埃希氏菌的報(bào)道，隨后世界養(yǎng)禽業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)逐漸有了關(guān)于大腸桿菌病不同病型的報(bào)道，由多種致病因子結(jié)合的禽致病性大腸埃希氏菌(Avian pathogenicE.coli,APEC)，可導(dǎo)致禽類的多種癥狀，最常見(jiàn)的是死胚、敗血癥、心包炎、卵黃性腹膜炎、關(guān)節(jié)炎、氣囊炎、肉芽腫等。由于臨床上抗菌藥物的長(zhǎng)期、不合理使用，導(dǎo)致耐藥菌株不斷增多。因此，急切地需要新型藥物的研發(fā)，以控制耐藥性致病菌引起的感染。噬菌體是一種廣泛存在于自然界中的病毒，對(duì)其宿主菌具有高效特異性的感染，并且不出現(xiàn)耐藥性。近年來(lái)噬菌體已應(yīng)用于臨床疾病的治療，并具有良好的效果。在現(xiàn)今雞大腸桿菌病治療的基礎(chǔ)上，筆者以本實(shí)驗(yàn)室前期分離得的雞致病性大腸埃希氏菌為宿主菌分離噬菌體，經(jīng)過(guò)篩選得到一株裂解性噬菌體，分析了其部分其生物學(xué)特征，并進(jìn)行了全基因組測(cè)序及分析，為該噬菌體用于臨床治療提供基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株和水樣45株雞大腸埃希氏菌均由石河子大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室分離鑒定與保存，污水采于石河子市及周邊養(yǎng)雞場(chǎng)。
1.1.2主要試劑DNaseI、RNase A、Mung Bean Nuclease、病毒總基因提取試劑盒為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；PEG4000為天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心產(chǎn)品；SM緩沖液、PBS緩沖液、LB的液體/半固體/固體培養(yǎng)基均在石河子大學(xué)動(dòng)科院傳染病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)配制所得。
1.1.3主要儀器高速冷凍離心機(jī)(Multifuge XLR)，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；透射電子顯微鏡(HT7700)，日立(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；測(cè)序儀(Miseq)，美國(guó)Illumina公司產(chǎn)品。
1.2方法
1.2.1宿主菌的準(zhǔn)備將本實(shí)驗(yàn)室保存于-80℃超低溫冰箱中的45株雞大腸埃希氏菌置于4℃環(huán)境下解凍。挑取在LB固體平板上劃線生長(zhǎng)出的單一菌落分別接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基中，于37℃、160 r/min條件下過(guò)夜富集培養(yǎng)，后置4℃保存。
1.2.2噬菌體的分離與純化
將污水水樣依次經(jīng)過(guò)無(wú)菌紗布和濾紙過(guò)濾，得到的濾液置于4℃過(guò)夜后，再用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。取除菌的污水濾液與45株雞大腸埃希氏菌各菌懸液依次加于液體LB培養(yǎng)基中，于錐形瓶中混勻，室溫靜止15 min，37℃、160 r/min培養(yǎng)7 h并于4℃過(guò)夜，10 000 r/min離心10 min，取上清液分別與45株雞大腸埃希氏菌菌懸液混合吸附后，用雙層瓊脂平板法過(guò)夜培養(yǎng)進(jìn)行噬菌體的分離。
用無(wú)菌牙簽挑取生長(zhǎng)良好的單個(gè)噬菌空斑至于100μL相應(yīng)宿主菌，吸附反應(yīng)15 min，加入5 mL液體LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)5 h，將離心倍比稀釋的培養(yǎng)液與宿主菌混合均勻后采用雙層瓊脂法培養(yǎng)，如此過(guò)程重復(fù)3次以上，直至在一個(gè)平板上形成形態(tài)單一的噬菌斑。即可得到純的噬菌體原液，將其置于-80℃(與500 mL/L甘油等體積混勻)保存和4℃?zhèn)溆谩?
1.2.3噬菌體的濃縮及電鏡觀察
采用超速離心法，進(jìn)行噬菌體濃縮，將裂解液上清在4℃下24 446×g，離心1.5 h，用SM緩沖液輕輕洗脫重懸每個(gè)離心管中的沉淀，最后將得到的濃縮液收集在1.5 mL無(wú)菌離心管中保存于-80℃?zhèn)溆?。?0μL噬菌體濃縮液滴于載玻片上，用精細(xì)鑷子輕輕夾取銅網(wǎng)(200目)放于噬菌體濃縮液液滴上，室溫下吸附2 min后取出，放于吸水紙上，去除銅網(wǎng)上的液體，滴一滴20 g/L的磷鎢酸染液在銅網(wǎng)上，靜置染色3 min取出，放于吸水紙上，用紅外燈照射30 min，以徹底除去水分與有害雜質(zhì)后，用HT7700透射電子顯微鏡觀察噬菌體的形態(tài)。
1.2.4噬菌體核酸類型的鑒定
噬菌體基因組的提取嚴(yán)格按照病毒基因DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)中的操作步驟進(jìn)行，將提取的核酸于37℃水浴條件下，用DNaseⅠ、RNase A與Mung Bean Nuclease分別對(duì)噬菌體的基因組消化2 h后，采用瓊脂凝膠電泳法對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。
1.2.5噬菌體全基因組的測(cè)序
將噬菌體基因組處理為約290 bp的測(cè)序文庫(kù)，利用Miseq測(cè)序儀完成測(cè)序工作，使用軟件Newbler 2.9與CLC 3.0對(duì)得到的基因組序列進(jìn)行序列組裝。測(cè)序工作由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物學(xué)流行病學(xué)研究所完成。利用MEGA7.0對(duì)所得序列進(jìn)行親緣關(guān)系的構(gòu)建。
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