低度酒主要包括果酒、黃酒、花酒等，是一種酒精含量低（一般在20%以下）的飲料酒，主要是利用谷物、水果、和鮮花為原料。由于其酒精含量低、品種繁多、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、消費(fèi)者的喜好以及公眾對(duì)嚴(yán)重的長(zhǎng)期健康影響的嚴(yán)重關(guān)注，低酒精葡萄酒主要以現(xiàn)代生活方式為導(dǎo)向。近年來(lái)中國(guó)貴州省充分利用自身豐富的糯米、水果等農(nóng)業(yè)資源，推動(dòng)市場(chǎng)上的低度酒產(chǎn)品越來(lái)越多，對(duì)擴(kuò)大消費(fèi)空間具有重要意義。在低度酒的發(fā)酵過(guò)程中，風(fēng)味是評(píng)價(jià)品質(zhì)的最重要特征之一。酯類(lèi)是影響風(fēng)味的物質(zhì)之一，由酵母發(fā)酵產(chǎn)生，是協(xié)調(diào)葡萄酒香氣的關(guān)鍵因素。
但仍存在香氣不顯眼、酒質(zhì)差、勾兌技術(shù)水平低等問(wèn)題，導(dǎo)致低度酒行業(yè)發(fā)展緩慢。為了提高工業(yè)生產(chǎn)中低度酒的酯含量，人們通過(guò)添加產(chǎn)酯酵母、延長(zhǎng)貯藏時(shí)間、優(yōu)化工藝條件等方法，嘗試使葡萄酒的香氣特征多樣化。然而這些方法會(huì)增加原料的損失，帶來(lái)不良?xì)馕?，降低葡萄酒的品質(zhì)。目前，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建高酯產(chǎn)率的釀酒酵母工程菌株已成為研究熱點(diǎn)。乙醇乙酰轉(zhuǎn)移酶（AAT）途徑是酵母產(chǎn)生酯類(lèi)代謝途徑中最重要的途徑，ATT基因的表達(dá)水平對(duì)乙酸的合成有顯著影響。EAT1是一種新型AAT基因，是酯合成途徑最后一端的關(guān)鍵限速酶，在酵母中催化乙酰輔酶A和乙醇生成乙酸乙酯。
本研究通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增編碼AAT的EAT基因構(gòu)建重組質(zhì)粒Yep-PEK，然后將Yep-PEK轉(zhuǎn)化釀酒酵母W303-1A構(gòu)建重組菌株W303-EAT。將重組菌株W303-EAT應(yīng)用于低度酒發(fā)酵過(guò)程中，研究EAT基因?qū)σ宜嵋阴ギa(chǎn)生和香氣產(chǎn)生特性的影響。該研究對(duì)未來(lái)低度酒酵母菌株的優(yōu)化具有重要的參考價(jià)值。
將重組菌株W303-EAT及其親本W(wǎng)303-1A在50 mL YPD培養(yǎng)基中以30°C和160 rpm預(yù)培養(yǎng)12 h，然后轉(zhuǎn)移到含有重組菌株W303-EAT或其親本W(wǎng)303的1 mL YPD培養(yǎng)基中-1A放入100 mL YPD培養(yǎng)基中，在30°C和160 rpm下培養(yǎng)24小時(shí)。使用Bioscreen全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀（每2小時(shí)測(cè)定一次光密度（OD 680）。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：研究表明重組菌株W303-EAT與其親本W(wǎng)303-1A相比，在生長(zhǎng)性能、CO 2損失、酒精含量和還原糖含量。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明AAT蛋白是一種疏水性、分泌性和非跨膜蛋白。然后用低度發(fā)酵酒研究了重組菌株W303-EAT與其親本菌株W303-1A在發(fā)酵性能和產(chǎn)香特性方面的差異。結(jié)果表明，用于發(fā)酵的重組菌株W303-EAT的米酒、藍(lán)莓酒和玫瑰酒產(chǎn)生的乙酸乙酯比其親本菌株W303-1A高。同時(shí)研究人員發(fā)現(xiàn)重組菌株W303-EAT發(fā)酵的米酒、藍(lán)莓酒和玫瑰酒中異丁醇、異戊醇和苯乙醇的含量低于其親本菌株W303-1A，表明重組菌株W303-EAT具有降低較高酒精含量的必然作用。
圖1、重組質(zhì)粒Yep-PEK的詳細(xì)構(gòu)建過(guò)程。
圖2、W303-1A(A)和W303-EAT(B)的細(xì)胞顯微形態(tài)。兩株菌株均為卵圓形，呈典型的單細(xì)胞形態(tài)，無(wú)胞間連鎖，細(xì)胞大小無(wú)明顯差異，充分說(shuō)明EAT基因的克隆和表達(dá)對(duì)其細(xì)胞形態(tài)無(wú)不良影響。
圖3、重組菌株W303-EAT及其親本W(wǎng)303-1A的生長(zhǎng)曲線。如圖所示，重組菌株W303-EAT的生長(zhǎng)曲線與其親本W(wǎng)303-1A相比略有差異，說(shuō)明EAT基因的過(guò)表達(dá)對(duì)菌株的生長(zhǎng)能力有特殊的影響。
圖4、W303-1A和W303-EAT不同低度酒[玫瑰酒(A)、藍(lán)莓酒(B)和黃酒(C)]中較高酒精含量的比較。星號(hào)（*）表示不同低度酒的酒精度較高，差異顯著。從圖中看出與W303-1A相比，重組菌株W303-EAT對(duì)低發(fā)酵葡萄酒中異丁醇、異戊醇和苯乙醇的含量降低有顯著性差異（P<0.05），表明重組菌株W303-EAT具有具有特殊的還原高級(jí)醇的作用，對(duì)改善酒的風(fēng)味具有重要意義。
圖5、W303-1A和W303-EAT不同低酒精度葡萄酒[玫瑰酒(A)、藍(lán)莓酒(B)和黃酒(C)]中乙酸乙酯含量的比較。星號(hào)（*）表示不同低度酒中乙酸乙酯含量。從圖中可以看出重組菌株W303-EAT可以提高玫瑰酒、藍(lán)莓酒、黃酒等低發(fā)酵酒發(fā)酵過(guò)程中乙酸乙酯的含量，對(duì)增強(qiáng)香氣和增強(qiáng)酒香起到積極的作用，改善酒的風(fēng)味。
總結(jié)：本研究采用同源重組原理構(gòu)建了過(guò)表達(dá)乙醇乙酰轉(zhuǎn)移酶（AAT）基因EAT的重組釀酒酵母菌株W303-EAT。結(jié)果表明重組菌株W303-EAT與其親本W(wǎng)303-1A相比，在生長(zhǎng)性能、CO2損失、酒精含量和還原糖含量。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明AAT蛋白是一種疏水性、分泌性和非跨膜蛋白。然后用低度發(fā)酵酒研究了重組菌株W303-EAT與其親本菌株W303-1A在發(fā)酵性能和產(chǎn)香特性方面的差異。結(jié)果表明用于發(fā)酵的重組菌株W303-EAT的米酒、藍(lán)莓酒和玫瑰酒產(chǎn)生的乙酸乙酯比其親本菌株W303-1A高。同時(shí)研究人員發(fā)現(xiàn)重組菌株W303-EAT發(fā)酵的米酒、藍(lán)莓酒和玫瑰酒中異丁醇、異戊醇和苯乙醇的含量低于其親本菌株W303-1A，表明重組菌株W303-EAT具有降低較高酒精含量的必然作用。本研究為研究過(guò)表達(dá)EAT基因的重組釀酒酵母W303-EAT的產(chǎn)香特性提供了新的思路。
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