惡性腫瘤體外細(xì)胞系的培養(yǎng)和建立，為惡性腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究提供了非常重要的實(shí)驗(yàn)手段和實(shí)驗(yàn)材料，在惡性腫瘤發(fā)病機(jī)理及新的治療措施探討中起著重要作用。卵巢癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤，其病死率高居各類婦科腫瘤的首位，體外建立卵巢癌細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，有著重要的意義。本研究自2007年12月從人復(fù)發(fā)性卵巢癌獲取原代培養(yǎng)細(xì)胞以來(lái)，歷時(shí)18個(gè)多月，傳代80余代，在體外成功建立起人卵巢癌細(xì)胞系，命名為OV1228，現(xiàn)將其建立過(guò)程及生物學(xué)特性報(bào)告如下。
1材料與方法
1.1主要試劑
RPMI 1640培養(yǎng)基，10%胎牛血清,青霉素100 U/mL，鏈霉素100μg/mL，0.125%胰酶，0.05%四甲基偶氮唑鹽(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)，0.1%Triton X-100，Tris HCl(pH 7.4)，0.55 mmol/L NaCl，10 mmol/L KCl等。
1.2人卵巢癌細(xì)胞株OV1228的建立
1.2.1一般資料患者，女性，59歲，于2007年12月28日行卵巢癌腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)。部分卵巢腫瘤標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)取材，脫水，石蠟包埋，制片(4μm厚)，HE染色。由病理專業(yè)人員在光學(xué)顯微鏡下閱片，癌變狀況如圖1所示，癌組織位于表面，多層排列，癌細(xì)胞核大、深染，有明顯的異型性。
圖1人卵巢癌OV1228細(xì)胞原組織來(lái)源病理切片(×200)
1.2.2腫瘤標(biāo)本及處理取部分無(wú)壞死的新鮮腫瘤組織標(biāo)本在層流超凈臺(tái)上，用Hank′s液洗滌2次后，剪成1 mm3大小組織，于200目金屬網(wǎng)篩上用注射器針?biāo)ㄝp輕研磨，用含青、鏈霉素的培養(yǎng)液RPMI 1640沖洗、過(guò)篩，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)單克隆化生長(zhǎng)后調(diào)細(xì)胞濃度為5×104/mL，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和傳代，取不同代數(shù)的細(xì)胞凍存于-196℃液氮中保種，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)特性分析。
1.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
相差顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，并進(jìn)行攝影；另接種細(xì)胞于100 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后用胰酶-EDTA液消化分散細(xì)胞，收集于10 mL管內(nèi)離心成細(xì)胞小團(tuán)，經(jīng)2.5%戊二醛鋨酸雙固定，Epon 812包埋，超薄切片、染色，在H-600型電鏡下觀察。
1.4細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定
以2.5×104/mL接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)24 h，從次日起，每天計(jì)數(shù)3孔細(xì)胞，取均值，連續(xù)7 d，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖曲線，根據(jù)Patterson公式，計(jì)算細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的倍增時(shí)間。
1.5軟瓊脂集落形成率
將1.25%的瓊脂煮沸溶解，稀釋成0.5%的瓊脂，加于60 mm平皿內(nèi)，凝固后將含單細(xì)胞的0.33%的瓊脂液接種于底層瓊脂上，接種密度為5.0×104個(gè)細(xì)胞/皿，置37℃，5%CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)，15 d后計(jì)數(shù)含30個(gè)細(xì)胞以上的集落，按公式計(jì)算出集落形成率：集落形成率=(集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。
1.6核型分析
細(xì)胞傳代后培養(yǎng)2 d，加入秋水仙素(1 ng/mL)繼續(xù)培養(yǎng)2 h后收獲細(xì)胞，按常規(guī)方法制備染色體進(jìn)行核型分析。
1.7裸鼠接種
裸鼠購(gòu)自北京動(dòng)物所，接種細(xì)胞時(shí)鼠齡為6周，培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，用無(wú)血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液接種于6只裸鼠右腋部皮下，每只裸鼠注射0.3 mL(1.0×107個(gè)細(xì)胞)，無(wú)菌條件下喂養(yǎng)，每周檢查3～4次，4周左右，當(dāng)瘤體總直徑達(dá)1 cm以上時(shí)照相后處死，取出腫塊作病理切片檢查。
2結(jié)果
2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
倒置顯微鏡下可見(jiàn)卵巢癌細(xì)胞邊緣清晰,形態(tài)以多角形、梭形或圓形卵石狀排列，見(jiàn)圖2A。透射電鏡顯示：瘤細(xì)胞呈簇或散在分布，細(xì)胞無(wú)明顯壞死和凋亡，細(xì)胞卵圓形或多邊形，胞質(zhì)豐富，表面有少量短的細(xì)胞突起，部分細(xì)胞間可見(jiàn)發(fā)育比較差的橋粒樣結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)電子密度低，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器稀少，可見(jiàn)少量線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，散在分布少量糖原顆粒，具有明顯的惡性卵巢癌細(xì)胞特征，見(jiàn)圖2B。
圖2光學(xué)和電子顯微鏡觀察OV1228細(xì)胞形態(tài)A：倒置顯微鏡顯示的卵巢癌原代細(xì)胞(×40)；B：電鏡顯示OV1228細(xì)胞表面有少量短的細(xì)胞突起，具有明顯的惡性卵巢癌細(xì)胞特征(bar=1μm)
2.2 OV1228細(xì)胞群體倍增時(shí)間的測(cè)定
根據(jù)每天記錄的細(xì)胞平均數(shù)，在座標(biāo)紙上繪出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，可見(jiàn)細(xì)胞在7～8 d達(dá)到峰值，細(xì)胞群體倍增時(shí)間為29.39 h(圖3)。
圖3 OV1228細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
2.3細(xì)胞集落形成率
細(xì)胞在軟瓊脂中培養(yǎng)15 d后，在倒置顯微鏡下計(jì)算>30個(gè)細(xì)胞的集落，根據(jù)公式計(jì)算出的集落形成率為17.5%。
2.4核型分析
對(duì)第50代細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)染色體分析，細(xì)胞核型為多倍體，染色體數(shù)目波動(dòng)在21～61條之間，多為亞二倍體，少數(shù)超三倍體。分析發(fā)現(xiàn)染色體、染色單體斷片，環(huán)狀染色體、雙微體、三射體等染色體畸變，畸變率為21.95%，見(jiàn)圖4。
圖4 OV1228細(xì)胞的核型分析(×1 000倍，Giemsa染色)
2.5異體致瘤性
卵巢癌細(xì)胞接種于裸鼠腋部皮下后，于第3周在接種部位出現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)，見(jiàn)圖5。第4周取出腫塊，其腫塊直徑在1.2～1.8 cm之間，腫塊病理組織學(xué)檢查表明其卵巢癌細(xì)胞形態(tài)與原實(shí)體瘤相似。
圖5 OV1228移植裸鼠腋部皮下后長(zhǎng)出腫塊
3討論
惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，受各種生物因素的影響。在體內(nèi)直接研究癌細(xì)胞的生物學(xué)特性有較大的難度，受到很多因素的制約，而在體外建立永生化的癌細(xì)胞系可免受機(jī)體內(nèi)各種因素的干擾，便于探討各種物理、化學(xué)、生物等因素對(duì)癌細(xì)胞生命活動(dòng)的影響，特別是在抗癌藥物的篩選及腫瘤免疫治療與基因治療方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。因此，建立人癌細(xì)胞系是研究人類腫瘤必不可少的重要手段。
癌細(xì)胞體外建系是一個(gè)漫長(zhǎng)而復(fù)雜的過(guò)程，特別是用原發(fā)腫瘤組織直接體外培養(yǎng)建系被認(rèn)為成功率極低。但我們?cè)谘芯课墨I(xiàn)的基礎(chǔ)上，從19例培養(yǎng)標(biāo)本中成功應(yīng)用原代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)并通過(guò)克隆稀釋法建立起人卵巢癌腫瘤細(xì)胞株OV1228，這些癌細(xì)胞在體外傳25代后，生長(zhǎng)速度明顯加快，并具有無(wú)限增殖能力。腫瘤生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常，細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)都具有腺上皮細(xì)胞癌結(jié)構(gòu)的特性，但細(xì)胞分化較差，具有高度異體致瘤性等惡性特征。以上特征說(shuō)明，我們已成功建立起新的人卵巢癌細(xì)胞株。OV1228卵巢癌細(xì)胞系的建立，豐富了人卵巢癌細(xì)胞系的類型，為進(jìn)一步研究卵巢癌的生物學(xué)特征提供了合適的體外模型。
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