濃香型白酒是中國(guó)四大基礎(chǔ)酒之一，典型特征就是采用泥窖固態(tài)發(fā)酵[1-2]。濃香型白酒經(jīng)泥窖發(fā)酵、蒸餾、勾調(diào)而成，窖泥中微生物豐富是濃香型白酒酯類豐富的主要原因之一，己酸乙酯是酒體中主要的呈香物質(zhì)，所以濃香型白酒以己酸乙酯為主體香[3]。乳酸乙酯也是濃香型白酒中最重要的呈香物質(zhì)之一，濃香型白酒中含有適量的乳酸乙酯可以提高白酒的品質(zhì)，過(guò)高或過(guò)低可能會(huì)導(dǎo)致濃香型白酒主體香味不突出和酒體粗糙[4]。
在白酒的釀造過(guò)程中，環(huán)境十分復(fù)雜，產(chǎn)乳菌產(chǎn)生過(guò)量的乳酸，導(dǎo)致酒體中乳酸含量過(guò)高，和乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成大量的乳酸乙酯，過(guò)量的乳酸乙酯是影響白酒風(fēng)味和品質(zhì)的重要指標(biāo)[5-6]。乳酸乙酯性質(zhì)穩(wěn)定，一旦形成很難分解，所以只能減少乳酸乙酯的前體物質(zhì)“乳酸”來(lái)達(dá)到降低乳酸乙酯的目的[7-8]。
本研究通過(guò)對(duì)老窖泥的篩選分離，篩選出能夠利用乳酸的微生物。通過(guò)鏡檢、分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，然后進(jìn)行乙醇的耐受性、pH的耐受性、葡萄糖存在條件下對(duì)乳酸的消耗情況研究，以期為將該菌株應(yīng)用到白酒中打下基礎(chǔ)，為濃香型或清香型白酒提高品質(zhì)提供一定的幫助。
1材料與方法
1.1材料、試劑及儀器
1.1.1材料
窖泥：湖北省某酒廠優(yōu)質(zhì)窖泥。
1.1.2培養(yǎng)基
乳酸鈉培養(yǎng)基：1%乳酸鈉，1%(NH4)2SO4，0.2%酵母膏，0.5%（NH4)2HPO4，配固體需要加入2%的瓊脂。115℃滅菌20 min。
乳酸鈉葡萄糖培養(yǎng)基：1%乳酸鈉，0.5%葡萄糖，1%(NH4)2SO4，0.2%酵母膏，0.5%（NH4)2HPO4。配固體需要加入2%的瓊脂，115℃滅菌20 min。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1初篩
取10 g窖泥放入90 mL滅過(guò)菌的生理鹽水中，振蕩15 min，用紗布過(guò)濾，得到的過(guò)濾液進(jìn)行梯度稀釋（10-2、10-3、10-4、10-5），取每個(gè)稀釋梯度液，使用涂布棒涂布于乳酸鈉固體培養(yǎng)皿中，34℃培養(yǎng)24 h，挑選能在乳酸鈉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物單菌落。
1.2.2復(fù)篩
將挑取的單菌落涂布于乳酸鈉固體培養(yǎng)皿中，每個(gè)挑取的單菌落至少劃線3次以上，得到的單菌落可以基本確定為能夠利用乳酸的微生物，挑選單菌落進(jìn)行鏡檢，觀察其形態(tài)特征[9]。
1.2.3優(yōu)良乳酸利用菌的篩選
將復(fù)篩得到的6株乳酸利用菌，接入乳酸鈉培養(yǎng)液中活化24 h，按照5%的接種量，將6株菌株分為2組，分別接種到乳酸鈉液體培養(yǎng)基中。1組在恒溫?fù)u床中進(jìn)行有氧培養(yǎng)，另一組在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行深層液體厭氧培養(yǎng)，每個(gè)組的菌株都在34℃下培養(yǎng)3 d，每個(gè)菌株做3個(gè)平行試驗(yàn)。
取每個(gè)菌株第1 d和最后1 d培養(yǎng)液各2 mL，使用高效液相色譜測(cè)樣品中的乳酸含量，通過(guò)2次乳酸差值計(jì)算出各菌株的乳酸利用量，選擇對(duì)乳酸利用較好的菌株進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。
1.2.4優(yōu)良乳酸利用菌發(fā)酵性能的測(cè)試
1.2.4.1葡萄糖對(duì)乳酸利用菌的影響
白酒釀造過(guò)程中含有一定的葡萄糖，因此在葡萄糖存在的條件下利用乳酸是菌株作為乳酸利用菌的重要指標(biāo)[10]。
將篩選得到的優(yōu)良乳酸利用菌，接種到乳酸鈉培養(yǎng)液中活化24 h，按照5%的接種量，將菌株活化培養(yǎng)液接種到乳酸鈉葡萄糖液體培養(yǎng)基中，34℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3 d，1組進(jìn)行有氧培養(yǎng)，1組進(jìn)行深層厭氧培養(yǎng)，每個(gè)菌株各做3個(gè)平行。取第1 d和第3 d發(fā)酵液各2 mL，使用高效液相色譜測(cè)發(fā)酵液乳酸含量和通過(guò)生物傳感分析儀測(cè)發(fā)酵液葡萄糖含量。
1.2.4.2優(yōu)良乳酸利用菌pH值耐受性的測(cè)試
將乳酸利用較好的兩株菌株進(jìn)行活化，活化好的菌液分別按照5%的接種量，接種在pH值為5.5、6.5、7.5、8.5、9.5的乳酸鈉培養(yǎng)液中。在34℃恒溫?fù)u床中進(jìn)行有氧培養(yǎng)3 d，每個(gè)梯度做3個(gè)平行試驗(yàn)，從1 d開始取樣，每天取樣2 mL，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液的OD600值，判斷菌株生長(zhǎng)狀態(tài)。
1.2.4.3優(yōu)良乳酸利用菌乙醇耐受性的測(cè)試
將優(yōu)良乳酸利用菌活化好的培養(yǎng)液，按照5%的接種量，分別接種在含有不同濃度梯度乙醇（0%、1%、2%、3%、4%、5%）的乳酸鈉培養(yǎng)液中[11]。在34℃恒溫?fù)u床中進(jìn)行有氧培養(yǎng)3 d，每個(gè)梯度做3個(gè)平行試驗(yàn)，從1 d開始取樣，每天取樣2 mL，測(cè)培養(yǎng)液OD600的值。
1.2.5發(fā)酵液分析方法
1.2.5.1乳酸的測(cè)定方法
乳酸的測(cè)定采用高效液相色譜法[12]。樣品處理：取100μL發(fā)酵液加入到900μL超純水中稀釋10倍，用0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，將濾液裝入進(jìn)樣瓶中進(jìn)樣。
1.2.5.2葡萄糖含量的測(cè)定方法
葡萄糖含量[13]：使用生物傳感儀進(jìn)行測(cè)定。用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行定標(biāo)，將稀釋10倍后的樣品，用微量進(jìn)樣器取25μL注入生物傳感儀測(cè)定。
1.2.5.3樣品菌液濃度的測(cè)定方法
使用分光光度計(jì)，用光密度（OD600值）表示樣品菌液濃度。
1.2.6優(yōu)良耗乳菌的菌種鑒定
（1）試劑盒提取基因組DNA；（2）PCR擴(kuò)增16S rDNA：96℃預(yù)變性5 min，96℃變性20 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃保溫10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，觀察條帶性狀；（3）將PCR產(chǎn)物送到華大基因測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行NCBI-BLAST比對(duì)[14]。
老窖泥篩選分離的6株乳酸利用菌培養(yǎng)、發(fā)酵性能、生長(zhǎng)范圍（一）
老窖泥篩選分離的6株乳酸利用菌培養(yǎng)、發(fā)酵性能、生長(zhǎng)范圍（二）
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