2結(jié)果與分析


2.1乳酸利用菌的培養(yǎng)結(jié)果


將能夠在乳酸鈉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株，根據(jù)其菌落特征分為6種不同類型的乳酸利用菌，初步命名為：R-0、R-1、R-2、R-3、R-4、R-5。見(jiàn)表1。

表1篩選乳酸利用菌的菌落和鏡檢結(jié)果


從表1可看出，6株微生物的細(xì)胞都是桿狀，菌落有所差異。R-0：菌落小、呈橢圓形、表面光滑；R-1：菌落大而粗燥、與培養(yǎng)基結(jié)合、不透明、菌落黃色；R-2：菌落小、濕潤(rùn)、表面光滑；R-3：菌落小、表面光滑、菌落呈淺黃色；R-4：菌落白色、小而光滑、邊緣齊整；R-5：菌落呈白色、不透明、邊緣呈花瓣?duì)睢?


2.2乳酸利用菌的篩選結(jié)果


培養(yǎng)基在滅菌過(guò)程中乳酸會(huì)有一定的揮發(fā)，所以樣品滅菌接種后從0 d開(kāi)始取樣。


如表2所示，在有氧且同樣培養(yǎng)3 d的條件下，6株菌株對(duì)乳酸的利用率基本都是100%。

表2有氧培養(yǎng)3 d各菌株乳酸的消耗量


如表3所示，在厭氧條件下，R-2和R-3菌株對(duì)乳酸的利用和其他菌株相比具有優(yōu)勢(shì)，R-2和R-3對(duì)乳酸的利用率為12.9%和16.0%，R-0、R-1、R-4、R-5對(duì)乳酸的利用率為10.4%、12.0%、7.1%、10.6%。

表3無(wú)氧培養(yǎng)3 d各菌株乳酸的消耗量


由以上結(jié)果分析得出，在有無(wú)氧條件下，6株微生物都可以利用乳酸，R-2和R-3菌株在厭氧條件下對(duì)乳酸的利用比其他菌株好。微生物在窖池的生長(zhǎng)條件大部分都是厭氧的，因此選擇R-2和R-3在厭氧條件下利用乳酸最多的菌株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。


2.3葡萄糖對(duì)乳酸利用菌的影響結(jié)果


如圖1所示，在有氧條件下，R-2和R-3分別利用乳酸2.16 g/L（28%）和2.99 g/L（40%），在相同的培養(yǎng)條件下，R-3對(duì)乳酸的利用率比R-2高12%；在無(wú)氧條件下，R-2和R-3分別利用乳酸0.65 g/L（8.6%）和0.73 g/L（9.7%），R-3對(duì)乳酸的利用率比R-2高1.1%。

圖1 R-2和R-3有氧無(wú)氧下培養(yǎng)3 d乳酸的消耗量及利用率


如圖2所示，在有氧條件下，R-2和R-3各利用葡萄糖1.25 g/L（46%）和1.37 g/L（50.7%），R-3對(duì)葡萄糖的利用率比R-2高4.7%；在無(wú)氧條件下，R-2利用葡萄糖0.99 g/L（37%），R-3利用葡萄糖1.13 g/L（42%），R-3對(duì)葡萄糖的利用率比R-2高5%。

圖2 R-2和R-3有氧無(wú)氧下培養(yǎng)3 d葡萄糖的消耗量及利用率


由上所述，R-2和R-3在葡萄糖存在時(shí)同樣可以利用乳酸，R-3比R-2在葡萄糖存在時(shí)對(duì)乳酸的利用更好。


2.4 pH值耐受性測(cè)的結(jié)果


如圖3所示，將R-2和R-3在34℃條件下培養(yǎng)3 d，R-3菌株在初始pH值為6.5、7.5、8.5時(shí)，OD600值都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，初始pH值為8.5時(shí)OD600值增長(zhǎng)最高，R-3菌株在初始pH值為5.5和9.5時(shí)，OD600值隨著時(shí)間的延長(zhǎng)基本沒(méi)有變化。這表明R-3菌株可以在pH值為6.5～8.5的培養(yǎng)液中正常生長(zhǎng)，最適pH為8.5。

圖3 pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響


與R-3菌株相比，R-2菌株只有在初始pH值為5.5時(shí)OD600值基本不變，在初始pH值為6.5、7.5、8.5、9.5時(shí)，OD600值都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)一直上升，特別是在初始pH值為8.5時(shí)OD600值增長(zhǎng)最高，這表明R-2菌株可以生長(zhǎng)的pH值范圍是6.5～9.5，最適生長(zhǎng)pH值為8.5。


綜上所述，R-2和R-3菌株可以正常生長(zhǎng)的pH值范圍為6.5～9.5。據(jù)報(bào)道，窖泥中的pH值在5.86～9.22范圍內(nèi)變化，完全符合這兩株乳酸利用菌對(duì)pH值的生長(zhǎng)需求[15-17]。


2.5乙醇耐受性結(jié)果


將R-2和R-3菌株接種于含有乙醇濃度為0%、1%、2%、3%、4%、5%的乳酸鈉培養(yǎng)基中，34℃下有氧培養(yǎng)3 d，結(jié)果如圖4所示。

圖4乙醇濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響


R-3菌株在接種后就進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，R-2菌株在1 d時(shí)才開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；R-2和R-3菌株在乙醇含量為0%～4%時(shí)，OD600值都可以快速增長(zhǎng)；在乙醇含量為5%時(shí)，2菌株受乙醇的抑制較為明顯，OD600值增長(zhǎng)較為緩慢。2菌株在乙醇含量為0%～4%可以快速生長(zhǎng)，與鎮(zhèn)達(dá)等[18]研究6株乳酸利用菌對(duì)乙醇的耐受性結(jié)果基本一致。


結(jié)果表明，2菌株都可以耐受5%以下的乙醇含量，R-3比R-2菌株能更快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，說(shuō)明R-3比R-2菌株能夠更快適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境。


2.6菌種鑒定結(jié)果


R-3和R-2菌株的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖5所示，孔號(hào)1是R-3菌株，孔號(hào)2是R-2菌株，測(cè)序結(jié)果在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，R-2為賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillussp.），R-3為熱帶桿菌（Bacillus tropicus）。


由圖5可知，R-2和R-3菌株經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到了高質(zhì)量的擴(kuò)增產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，選取相似度高的比對(duì)結(jié)果使用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖6所示。

圖5 R-3和R-2菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果


由圖6可知，R-2菌株與芽孢桿菌相似度最高，R-3菌株與熱帶桿菌相似度最高。

圖6 R-2和R-3菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)


3結(jié)論


通過(guò)對(duì)老窖泥的分離篩選，得到了6株能夠利用乳酸的菌株。選擇R-2和R-3這兩菌株在厭氧條件下對(duì)乳酸利用較好的微生物進(jìn)行研究。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定R-2為賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillussp.），R-3為熱帶桿菌（Bacillus tropicus），R-2和R-3菌株在34℃都可以耐受5%的乙醇含量，R-2菌株pH生長(zhǎng)范圍是6.5～8.5，R-3菌株pH生長(zhǎng)范圍是6.5～9.5，最適生長(zhǎng)pH都是8.5；在葡萄糖存在時(shí)兩菌株仍然可以利用乳酸，有氧時(shí)，R-3對(duì)乳酸的利用率比R-2高12%，厭氧時(shí)，R-3對(duì)乳酸的利用率比R-2高1.1%。兩菌株對(duì)白酒降低乳酸乙酯有一定的應(yīng)用與參考價(jià)值。


老窖泥篩選分離的6株乳酸利用菌培養(yǎng)、發(fā)酵性能、生長(zhǎng)范圍（一）

老窖泥篩選分離的6株乳酸利用菌培養(yǎng)、發(fā)酵性能、生長(zhǎng)范圍（二）

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