【摘要】目的評(píng)估兩株流感H10亞型重配病毒在不同細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)特性，篩選可用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞。方法基于A/Jiangxi-donghu/346/2013(H10N8)病毒的表面基因，利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建以高產(chǎn)PR8病毒為骨架的RG-H10N8(6+2)和RG-H10N1(7+1)兩種重配病毒，在SPF雞胚增殖病毒后，經(jīng)序列測(cè)定確認(rèn)，以質(zhì)粒拯救RG-PR8病毒為對(duì)照，比較病毒在MDCK和Vero細(xì)胞上的生長(zhǎng)敏感性；以相同MOI感染MDCK細(xì)胞后，比較病毒的生長(zhǎng)特性。結(jié)果兩種流感H10重配病毒和RG-PR8病毒在MDCK細(xì)胞上均能檢測(cè)到病毒滴度，但是在Vero細(xì)胞上，RG-H10N8檢測(cè)不到病毒滴度，RG-H10N1和RG-PR8可以檢測(cè)到病毒滴度；用相同的MOI感染MDCK細(xì)胞后，RG-PR8生長(zhǎng)能力強(qiáng)于兩種重配病毒，兩種重配病毒間差異不大。結(jié)論兩種流感H10重配病毒在MDCK細(xì)胞上生長(zhǎng)能力較好，MDCK較Vero細(xì)胞對(duì)H10重配病毒更敏感，來(lái)源不同的NA會(huì)影響病毒在Vero細(xì)胞上的生長(zhǎng)敏感性。
流感病毒在人群可造成季節(jié)性流感或流感大流行，接種疫苗是預(yù)防流感最有效的途徑。由于流感病毒容易變異，因此世界衛(wèi)生組織每年組織疫苗推薦會(huì)，以確定新的季節(jié)性流感疫苗株，同時(shí)篩選可能會(huì)造成流感大流行的動(dòng)物源性流感病毒疫苗株。為了快速獲得有效高產(chǎn)的疫苗株，需要構(gòu)建含有表面蛋白HA和NA，內(nèi)部基因來(lái)源于經(jīng)實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期篩選的在雞胚中高產(chǎn)并減毒的A/PR/8/34(H1N1)(簡(jiǎn)稱(chēng)PR8)毒株，即6+2重配策略，或僅替換表面HA基因，其余基因均使用PR8，即7+1重配。構(gòu)建重配病毒的方法包括經(jīng)典重配和反向遺傳技術(shù)，后者能夠快速獲得重配疫苗株。2013年我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)人感染H10N8禽流感病例，并在同一地區(qū)又接連發(fā)生兩例病例，在隨后的流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，該病毒來(lái)源于活禽市場(chǎng)，因此快速獲得H10N8流感疫苗株是防控的重要手段。
本研究利用反向遺傳技術(shù)，構(gòu)建了兩種不同基因構(gòu)成的H10亞型重配病毒，兩種病毒分別感染MDCK和Vero細(xì)胞，比較病毒在兩種細(xì)胞上的生長(zhǎng)敏感性，以及在敏感細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性，篩選出更適于病毒生長(zhǎng)的細(xì)胞系，為未來(lái)生產(chǎn)細(xì)胞基質(zhì)疫苗奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1細(xì)胞和病毒
MDCK和Vero細(xì)胞由國(guó)家流感中心保存，野生型病毒A/Jiangxi-donghu/346/2013(H10N8)(簡(jiǎn)稱(chēng)JX346)分離自首例人感染H10N8病例，由國(guó)家流感中心分離并保存。
1.2重配病毒的構(gòu)建
利用國(guó)家流感中心反向遺傳技術(shù)平臺(tái)系統(tǒng)中的A/PR/8/34(簡(jiǎn)稱(chēng)PR8)骨架質(zhì)粒系統(tǒng)，按照之前發(fā)表的拯救方法構(gòu)建重配病毒；同時(shí)制備重配的PR8病毒作為對(duì)照病毒；以上病毒均經(jīng)SPF雞胚傳代擴(kuò)增一次用于本實(shí)驗(yàn)。
1.3序列測(cè)定與分析為確認(rèn)兩株H10重配病毒HA和NA基因來(lái)源，將病毒按照國(guó)家流感中心標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，使用德國(guó)Qiagen公司的RNeasy Mini Kit(74106)提取核酸RNA，使用科室引物庫(kù)中兩端帶有M13序列的正反向引物，用德國(guó)Qiagen公司one-step RT-PCR kit(210212)擴(kuò)增HA和NA基因，擴(kuò)增后基因經(jīng)Affymetrix公司的USB PCR產(chǎn)物純化酶純化后，使用3730xl測(cè)序儀測(cè)序，使用Lasergene(Version 7.1.0)軟件拼接，使用BioEdit(Version 7.1.3.0)分析序列。
1.4病毒滴度測(cè)定
1.4.1細(xì)胞組織中病毒滴度測(cè)定：于96孔板中制備單層細(xì)胞，每孔100μl PBS洗兩次，將病毒稀釋液以每孔100μl接種于細(xì)胞上，每稀釋度4個(gè)復(fù)孔，置37℃的5%C02培養(yǎng)箱吸附1 h，棄病毒感染液，PBS洗兩次；每孔加100μl病毒維持液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，觀察CPE并取上清作HA血凝實(shí)驗(yàn)。
1.4.2雞胚組織中病毒滴度測(cè)定：將病毒做稀釋?zhuān)悦肯♂尪?00μl l接種4枚雞胚，35℃培養(yǎng)48h后收尿囊液作HA血凝實(shí)驗(yàn)；HA血凝實(shí)驗(yàn)用1%豚鼠紅細(xì)胞測(cè)定，結(jié)果按Reed—Muench方法計(jì)算TCID50和EID50。
1.5生長(zhǎng)曲線測(cè)定
將病毒分別以MOI=0.1，0.01和0.001感染細(xì)胞，在感染后24 h、48 h和72 h分別收取感染細(xì)胞上清后，放置在微生物生長(zhǎng)曲線分析儀中，設(shè)置為-80℃保存，所有樣本統(tǒng)一解凍后用1%豚鼠紅細(xì)胞測(cè)定HA血凝滴度，根據(jù)HA結(jié)果繪制生長(zhǎng)曲線。
相關(guān)新聞推薦
1、水稻土中光合微生物生長(zhǎng)及鐵還原過(guò)程對(duì)生物炭的響應(yīng)
2、一個(gè)全新的細(xì)菌生長(zhǎng)調(diào)控的權(quán)衡理論體系，與國(guó)際主流觀點(diǎn)有何不同
3、不同耐藥性致病副溶血性弧菌在20℃、25℃、37℃下的生長(zhǎng)曲線（二）