糖尿病足(diabetic foot ulcer，DFU)是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，近年來已經(jīng)成為發(fā)達(dá)國家非創(chuàng)傷性截肢的首要原因[1]。DFU與外周微血管病變和慢性炎癥等因素相關(guān)，常導(dǎo)致足部感染和潰瘍。DFU潰瘍創(chuàng)面主要病理特征為膠原合成不良，慢性炎癥反應(yīng)，生長因子合成減少，血管再生、肉芽組織形成及上皮再生困難等[2]。糖尿病患者體內(nèi)微血管病變是糖尿病并發(fā)癥的主要原因。引起糖尿病微血管病變的因素較多，但血管內(nèi)高血糖對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是主要因素。
血管內(nèi)皮細(xì)胞是一種多功能細(xì)胞，它是血管與外周組織進(jìn)行物質(zhì)交換的屏障，在血管生成、炎癥反應(yīng)與免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要功能。血管內(nèi)皮細(xì)胞通過發(fā)揮其生理功能參與體內(nèi)多種疾病的病理生理過程，并已成為動脈粥樣硬化等心腦血管疾病、血管瘤、炎癥、器官移植等相關(guān)疾病的治療靶點[3]。因此，短期高效獲得血管內(nèi)皮細(xì)胞，為研究相關(guān)疾病奠定了基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料、試劑及儀器
2型糖尿病db/db小鼠由南京大學(xué)模式動物研究所提供。CCK-8購自加拿大Biotium公司。胎牛血清，青霉素-鏈霉素雙抗，DMEM培養(yǎng)基，胰酶購自Invitrogen公司。96孔培養(yǎng)板和6孔培養(yǎng)板購自Corning公司。CO2培養(yǎng)箱購自Fouma Scientific Inc USA。酶標(biāo)儀購自Labsystems Finland。
1.2血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)
將2型糖尿病db/db小鼠頸椎脫臼處死，置入75%的乙醇中浸泡消毒5min，然后將小鼠置于無菌操作臺并固定四肢。將小鼠胸腹腔逐層切開并暴露胸主動脈和腹主動脈，在脊柱左側(cè)找到主動脈后解剖分離主動脈。分離胸、腹主動脈后立即放入含PBS的平衡液中，用注射器反復(fù)沖洗去除血管內(nèi)的血細(xì)胞。將沖洗干凈的動脈置于含DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，縱行切開動脈后將血管剪成大小約1mm×1mm的組織塊，并將血管面朝下置于6孔板上放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)60h后觀察細(xì)胞生長情況，并將組織塊去除并進(jìn)行換液，以后每2天換液1次。
1.3血管內(nèi)皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)
當(dāng)細(xì)胞融合成單層分布時按1∶2傳代培養(yǎng)。用PBS液洗滌，然后加入0.25%胰蛋白酶，用移液器反復(fù)吹打充分消化，通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞變圓形時，用含10%FBS的DMED培養(yǎng)基終止消化。離心后除去培養(yǎng)液，用D-hanks液沖洗1～2次。當(dāng)細(xì)胞生長融合達(dá)到70～80%時，進(jìn)行傳代。重復(fù)上述傳代過程2～3次，獲得細(xì)胞均為血管內(nèi)皮細(xì)胞。
1.4血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)觀察和生長曲線檢測
1.4.1形態(tài)學(xué)鑒定通過倒置相差顯微鏡觀察原代血管內(nèi)皮細(xì)胞和傳代血管細(xì)胞。
1.4.2生長曲線測定使用第4代血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行生長曲線檢測，將含10%FBS的DMED培養(yǎng)基使細(xì)胞數(shù)量重懸至2.5×104/mL，每孔加入細(xì)胞懸液100μL，每組設(shè)3個復(fù)孔，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。用CCK-8檢測細(xì)胞增值，每孔加入10Ul CCK-8溶液，通過酶標(biāo)儀在450nm波長下檢測每孔的OD值，重復(fù)測量3次。按上述步驟操作，連續(xù)檢測8天的OD值，繪制細(xì)胞生長曲線。
1.5統(tǒng)計方法
通過SPSS20.0軟件對OD值數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示。
2結(jié)果
2.1原代與傳代細(xì)胞
血管組織塊貼壁培養(yǎng)60h后，通過倒置顯微鏡可見許多細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，細(xì)胞呈扁平狀，核橢圓形，如圖1A所示。將組織塊移除后并換液，繼續(xù)培養(yǎng)4～5d血管內(nèi)皮細(xì)胞開始大量增值，當(dāng)細(xì)胞生長融合至70%～80%時按1：2比例傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞傳代后生長狀態(tài)較好，細(xì)胞呈鵝卵石樣，如圖1B所示。
圖1血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)
(A)血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，組織塊貼壁培養(yǎng)60h后，血管內(nèi)皮細(xì)胞從組織塊邊緣爬出；(B)第3代血管內(nèi)皮細(xì)胞。標(biāo)尺為100μm(放大倍數(shù)×100)
2.2生長曲線
細(xì)胞培養(yǎng)第1、2、3、4、5、6、7、8d后，通過酶標(biāo)儀檢測其OD值，繪制生長曲線如圖2所示。細(xì)胞生長規(guī)律為：接種第1d和第2d細(xì)胞數(shù)均較少，第3d細(xì)胞開始增生明顯，第3～5d細(xì)胞表現(xiàn)為對數(shù)生長；第5d后細(xì)胞增殖速度下降。細(xì)胞整個生長曲線近似橫置“S”形改變，表現(xiàn)為“潛伏期-對數(shù)生長期-平臺期”的生長方式。
圖2血管內(nèi)皮細(xì)胞生長曲線
4討論
糖尿病足的創(chuàng)面由于伴隨慢性炎癥和血管增生減少，因此，糖尿病足臨床治療比較困難。對于糖尿病足慢性創(chuàng)面的清創(chuàng)處理，要建立在局部血液循環(huán)改善的基礎(chǔ)上進(jìn)行，因此，增加局部血液循環(huán)尤其重要。目前糖尿病足治療方法較多，包括局部介入治療、擴(kuò)血管藥物的使用、高壓氧治療以及干細(xì)胞移植和基因治療等[3]。如果能全面了解創(chuàng)面血管內(nèi)皮細(xì)胞的生理特點，為臨床治療和機(jī)制研究提供良好的條件。因此,體外建立血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系尤為重要。
血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)是研究血管生成及其相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制的重要手段，體外快速高效獲得血管內(nèi)皮細(xì)胞是研究的基礎(chǔ)[4]。該實驗結(jié)果表明，采用組織塊法可以在體外成功獲得血管內(nèi)皮細(xì)胞，這是體外構(gòu)建血管模型的細(xì)胞來源之一。在實驗過程中，通過差異貼壁篩選血管內(nèi)皮細(xì)胞，并對其生長過程進(jìn)行檢測，為研究其生物學(xué)特性和藥物作用機(jī)制提供了良好的細(xì)胞模型。
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