芳香族氧苯氧丙酸酯（AOPPs）是選擇性的出苗后除草劑，用于控制含有均質(zhì)乙酰輔酶A羧化酶的一年生和多年生禾本科雜草（野燕麥、稗草、綠鬃草、普通海棠草、野小米和鵝草），對含有異質(zhì)乙酰輔酶A羧化酶的闊葉雜草和雙子葉植物沒有活性。AOPPs是一種內(nèi)部吸收的傳導(dǎo)性除草劑，從葉片表面吸收，通過木質(zhì)部和韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)到整個(gè)植物中，并在分生組織中積累，抑制脂肪酸的生物合成，導(dǎo)致雜草壞死。2014年，AOPP的全球銷售額達(dá)到121.7億美元，占全球除草劑市場的4.6%。
Quizalofop-p-ethyl（QPE）是一種單一R構(gòu)型AOPP[5]，由日產(chǎn)化學(xué)工業(yè)公司于1984年開發(fā)，被宣布為除草劑商業(yè)制劑中的活性成分。預(yù)計(jì)QPE將在未來幾年迅速增加，以克服草甘膦抗性雜草的廣泛出現(xiàn)。由于性能優(yōu)異，QPE被用于馬鈴薯、大豆、甜菜、花生、油菜、向日葵、蔬菜、棉花、亞麻等闊葉植物等作物。
QPE的廣泛應(yīng)用在以下幾個(gè)方面導(dǎo)致了有害影響：混合膽汁淤積/肝細(xì)胞肝損傷；脂肪酸降解途徑中基因表達(dá)的改變；對雄性大鼠的生殖毒性；內(nèi)分泌紊亂和急性毒性；對泥鰍和大鱗副泥鰍的遺傳毒性；對斜生四鏈藻和小檸檬的植物毒性；對哈茨木霉等土壤微生物的微生物毒性；QPE及其主要代謝物QPE（QP）可以被對映選擇性降解，QP(LC50:26.69μg cm?2)對赤子愛勝蚓的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于QPE(LC50:209.2μg cm?2)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）對藥物不良反應(yīng)的定義（2000年）和美國環(huán)境保護(hù)署（EPA）的III類毒性（2011），QPE是一種有毒化學(xué)物質(zhì)，已被歐盟禁止。一些國家對其使用設(shè)置了限制：加拿大的QPE在蔬菜上的最大殘留量限制為0.06 mg/L，但QPE在中國可以不受限制地自由使用。過度使用的QPE甚至是一種原水污染物，因此消除QPE的殘留對環(huán)境修復(fù)至關(guān)重要。
由于其環(huán)保的特性，利用微生物工藝修復(fù)污染場所已被證明是有效和可靠的。因此，近年來已經(jīng)分離出一系列對不同AOPPs具有降解能力的微生物。從Pseudomonas，Aquamicrobium，Acinetobacter，Ochrobactrum，及Rhodococcus中鑒定出一些酯酶可以在細(xì)胞外降解QPE。其中大部分屬于V、VII、VIII家族，氨基酸序列的相似性差異很大。然而，對細(xì)菌降解特性的研究還不足以用于實(shí)際的生物修復(fù)。QPE的降解只停留在前期階段，即QPE向QPE的主要代謝物QP的轉(zhuǎn)化。到目前為止，還沒有研究報(bào)道過單個(gè)菌株降解QP的情況。其降解機(jī)制尚不清楚。因此，迫切需要QPE優(yōu)越的降解細(xì)菌資源和完整的礦化途徑。
化學(xué)品和試劑
QPE標(biāo)準(zhǔn)（純度98.7%）、環(huán)氟丁基（純度96.5%）、丙炔基（純度98.2%）、非諾沙對乙基（純度99.2%）、氟氧甲基（純度98.2%）、氟丁基（純度94.8%）、二氟甲基（純度99.6%）、氟（97.9%）、氟（9%純度99%）、純度（純度94.1%）購自沈陽化工研究院有限公司。喹啉(QP，>純度95%）、（4-（6-氯喹啉-2-環(huán)氧基）苯酚(CYP，純度95%）和喹啉（純度95%）購自Sigma。所有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的原液（1×104 mg/L）均用甲醇溶解（HPLC級）制備。
培養(yǎng)基
礦物鹽培養(yǎng)基(MSM)：1.5 gNH4NO3,0.5 gKH2PO4·12H2O,1.5 gK2HPO4,0.2 gMgSO4·7H2O,0.5 gNaCl，和1‰（v/v）微量元素溶液（TES）。TES：FeSO4·7H2O(2.0 g/L),ZnSO4(0.1 g/L),CuSO4·5H2O(0.03 g/L),MnCl·4H2O(0.03 g/L),CoCl·7H2O(0.3 g/L),Na2MoO4·2H2O(0.03 g/L)和Na2WO4·2H2O(0.02 g/L)。NaCl溶液(200 mg/mL)：20 gNaCland100 mLMSM.Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基：10 g/Lpeptone,5 g/L酵母粉和10 g/LNaCl。用氫氧化鈉或鹽酸（2mol/L）將所有培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為7.0±0.2。所有培養(yǎng)基在121℃下高壓滅菌20min。每升加入16g瓊脂制備MSM和LB的固體培養(yǎng)基。
生長和降解實(shí)驗(yàn)
將分離株YC-XJ1在含有50 mg/L QPE和5‰甲醇的100 mL MSM培養(yǎng)基中生長約28 h，離心（5000 rpm，10分鐘），然后用新鮮MSM洗滌3次，調(diào)節(jié)至約OD600=1.0.將細(xì)菌懸浮液接種（1%，v/v）接種到含有50 mg/L QPE和5‰甲醇的10 mL MSM中（即補(bǔ)充有50μL QPE儲備溶液），并在30°C和180 rpm下孵育。每隔12 h孵育一次，用紫外可見分光光度計(jì)（Thermo Scientific，Massachusetts，USA）監(jiān)測細(xì)菌生長，并通過HPLC測定QPE的殘留濃度。每次處理分三次重復(fù)進(jìn)行，并將未接種的樣品設(shè)置為對照。
細(xì)菌富集及其降解QPE的能力
在本研究中，QPE（50 mg/L）在5 d內(nèi)被連續(xù)富集產(chǎn)生的細(xì)菌培養(yǎng)物完全降解。從固體MSM板中分離純化出一種好氧粉紅色QPE降解細(xì)菌，該菌株被命名為YC-XJ1。圖1a顯示了QPE的降解和菌株YC-XJ1的生長。在pH 7.0和30°C條件下，約97%的QPE（50 mg/L）可在96 h內(nèi)降解。QPE的降解速率與菌株YC-XJ1的生長曲線呈正相關(guān)。YC-XJ1在MSM平板上的菌落形態(tài)為粉紅色、光滑、圓形、突出。菌株YC-XJ1是革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，其兩端在顯微鏡下染色較深。TEM照片顯示，如Fournier等所述，圖1b中，桿狀細(xì)菌大小為2-8μm×0.5-2μm，兩端凸彎曲結(jié)構(gòu)，鞭毛長而薄且空心。
BIOLOG Gen III微孔板屬種鑒定結(jié)果為M.extorquens，SIM值0.682，>0.5，DIST值4.533，<5，在置信區(qū)間內(nèi)。
生理生化特性表明，菌株YC-XJ1具有利福霉素耐藥性，對萘啶酸、碲酸鉀和四唑紫敏感。在碳源檢測實(shí)驗(yàn)中，僅在甲酸、α-酮戊二酸和L-蘋果酸中發(fā)現(xiàn)了陽性結(jié)果（圖S2）。YC-XJ1不能利用任何糖類的結(jié)果可能是LB中不生長的原因。
利用BLAST軟件對16S rRNA基因序列（1446 bp）進(jìn)行比對，與M.populi BJ001的同源性為99.7%，與M.extorquens的同源性為99.5%,與M.thiocyanatum的同源性為99.3%。構(gòu)建了包含23株甲基桿菌類型的系統(tǒng)發(fā)育樹。最大似然分析結(jié)果顯示（圖1c），菌株YC-XJ1的最近親緣關(guān)系分別為M.populi和M.thiocyanatum。
YC-XJ1的基因組序列與M.populi基因組的平均核苷酸同源性性為97.9%，基因組覆蓋率為88.6%。因此，菌株YC-XJ1最終被鑒定為M.populi。
圖1.菌株YC-XJ1的形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析。（a）菌株YC-XJ1的生長曲線和50 mg/L QPE的降解曲線。（b）透射電子顯微鏡下菌株YC-XJ1的。（c）基于16S rDNA序列分析的菌株YC-XJ1系統(tǒng)發(fā)育樹。使用Kimura雙參數(shù)G+I參數(shù)模型和1000次重復(fù)的bootstrap分析構(gòu)建最大似然樹。
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