乳鐵蛋白（Lactoferrin，Lf）作為典型的食源性抗菌蛋白，是一種鐵結(jié)合糖蛋白，主要來(lái)源于牛、人、豬等哺乳動(dòng)物的乳汁中。它不僅參與生物體內(nèi)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)，促骨細(xì)胞生長(zhǎng)、分化，而且具有抗微生物、抗病毒、抗氧化、抗癌等功能。其中，最突出的功能是其廣譜的抗菌活性。尤其是乳鐵蛋白在胃蛋白酶水解作用下，釋放乳鐵蛋白肽（乳鐵蛋白cin）具有更出色的生物活性。大量研究表明，乳鐵蛋白對(duì)多種革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌以及一些真菌表現(xiàn)出良好的抑制能力。人體服用很多抗菌蛋白無(wú)毒副作用，并且其在體內(nèi)還可以被蛋白酶降解，雙重安全的保證使得抗菌蛋白在食品工業(yè)中將有著廣闊的應(yīng)用前景。
大量研究報(bào)道均重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)乳鐵蛋白作為天然食品防腐劑“低毒高效”的優(yōu)勢(shì)，而對(duì)乳鐵蛋白是否能夠促進(jìn)微生物生長(zhǎng)繁殖的問(wèn)題，鮮有報(bào)道。食源性抗菌蛋白的分子本質(zhì)是蛋白質(zhì)，可為微生物生長(zhǎng)N源和C源兩大營(yíng)養(yǎng)要素。在微生物的生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中，可能促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)。因此，本實(shí)驗(yàn)以乳鐵蛋白為對(duì)象，研究其在抑菌試驗(yàn)中，不同濃度作用下，對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)抑制或促進(jìn)的情況。通過(guò)改變大腸桿菌的初始密度，觀察乳鐵蛋白抑菌效果的變化，并對(duì)比不同來(lái)源乳鐵蛋白的作用效果，增加實(shí)驗(yàn)的可信度。
1材料與方法
1.1材料
乳鐵蛋白（分別選用以下三個(gè)公司的樣品：荷蘭的DMV、澳大利亞的Tatua Corporate Profile、新西蘭的Westland Milk Products）；大腸桿菌：由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；UV-2401PC紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DELTA 320型pH計(jì)、電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；試劑配制與培養(yǎng)基配制使用雙蒸水。
1.2方法
1.2.1蛋白質(zhì)含量的測(cè)定
總蛋白質(zhì)的測(cè)定采用凱氏定氮法（GB/T 5009.5-2003），配制鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液參考GB/T 5009-1-2003，配制溴甲酚綠-甲基紅混合指示劑參考GB/T 5009-1-2003。計(jì)算方法如下：
樣品蛋白含量=樣品中總蛋白含量/樣品總質(zhì)量*100%
實(shí)驗(yàn)中所用的乳鐵蛋白樣品，均換算為純蛋白質(zhì)后配制溶液。
1.2.2大腸桿菌濁度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
將對(duì)數(shù)期的大腸桿菌接種于葡萄糖蛋白胨（PYG）培養(yǎng)基中，接種量為2%，37℃搖床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，選擇不同培養(yǎng)時(shí)間，用分光光度計(jì)（OD625）分別測(cè)定培養(yǎng)物的濁度，同時(shí)取該濁度的菌液，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)（GB4789.2-94），得到吸光值-菌密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.3不同濃度的乳鐵蛋白對(duì)大腸桿菌的抑制作用測(cè)定
抑菌性的測(cè)定采用微量稀釋法，參考美國(guó)臨床標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)推薦的抗菌性的測(cè)定方法（NCCLS）。選用葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基，接種的大腸桿菌在37℃下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。具體方法如下，先將乳鐵蛋白配置成100 mg/mL的溶液，用孔徑為0.22μm的醋酸纖維膜過(guò)濾除菌，再用無(wú)菌水將其調(diào)整成不同濃度，使得PYG培養(yǎng)基中加入等體積的乳鐵蛋白溶液后，得到乳鐵蛋白終濃度分別為0、2、4、6、8、10 mg/mL的PYG培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)17 h的新鮮大腸桿菌接種于培養(yǎng)基中接種比例為2%，混勻，分裝于無(wú)菌試管中，每支試管3 mL，置于37℃下培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，測(cè)定625 nm處的OD值。
三組樣品均采用上述方法測(cè)定抑菌性，每組樣品每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，重復(fù)3次。為保證大腸桿菌菌落總數(shù)測(cè)定值的穩(wěn)定和濁度測(cè)定的可信度，所有涉及培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)操作均置于冰桶內(nèi)，單次測(cè)定操作時(shí)間不超過(guò)15 min。
1.2.4大腸桿菌污染程度對(duì)乳鐵蛋白抑菌性影響的測(cè)定
使用6 mg/mL的樣品1的乳鐵蛋白添加到PYG培養(yǎng)基中，接種對(duì)數(shù)期大腸桿菌菌液，接種量分別為2%、3%、4%、5%，使菌密度分別達(dá)到1.01×107、1.51×107、2.01×107、2.52×107cfu/mL，分裝于無(wú)菌試管中，測(cè)定不同時(shí)間的濁度，方法同2.3中所述。
1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
本研究中所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS16.0軟件中的單因素方差分析（One-way AVONA）和Duncan′s多重比較法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異顯著。
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