研究簡介
生物防治劑(BCA)的開發(fā)得到了顯著推動(dòng)，因?yàn)樵S多作物保護(hù)化學(xué)組已從歐盟批準(zhǔn)的用于農(nóng)業(yè)/園藝作物的化合物清單中刪除。由于BCA是活生物體，它們的使用和功效在很大程度上取決于環(huán)境條件，而對(duì)于化學(xué)產(chǎn)品，這種影響不太顯著。雖然以前的研究主要集中在這種酵母生物防治劑的液體制劑上，但關(guān)于干燥制劑及其在不同相互作用環(huán)境條件下的彈性的信息很少。最近Carb等人研究了用于提高收獲前應(yīng)用的生物防治劑干制劑的生存和環(huán)境壓力耐受性的潛力。這些是基于流化床噴霧干燥的配方，包括可生物降解的涂層。這種方法還可以提供對(duì)不同作物上的真菌病原體具有更廣泛活性的制劑。因此人們有興趣開發(fā)一種環(huán)境篩選系統(tǒng)，以促進(jìn)BCA配方的比較和識(shí)別，這可能具有所需的生態(tài)恢復(fù)力，特別是對(duì)于收獲前的應(yīng)用。其中一種方法是使用Bioscreen C全自動(dòng)生長曲線分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)允許在不同相互作用的非生物和營養(yǎng)因素下自動(dòng)比濁測(cè)量活力和恢復(fù)力。本論文的研究的目標(biāo)是（a）優(yōu)化Bioscreen C全自動(dòng)生長曲線分析系統(tǒng)以清酒假絲酵母菌CPA-1的生長，（b）比較溫度（15-30°C）相互作用的環(huán)境因素的影響)、pH(3–7)和水分活度(aw;0.94–0.99)對(duì)液體的商業(yè)配方和BCA清酒假絲酵母菌CPA-1的兩種干燥配方的活力和生長的影響，使用優(yōu)化的比濁法和(c)確定清酒CPA-1配方在相互作用的環(huán)境條件下生長的檢測(cè)時(shí)間，以比較它們的彈性。
Bioscreen全自動(dòng)生長曲線分析儀的應(yīng)用
Bioscreen C全自動(dòng)生長曲線分析儀用于分析濁度。對(duì)于所有測(cè)定，在非標(biāo)準(zhǔn)100孔微量滴定板的每個(gè)孔中加載200μl接種培養(yǎng)基。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)所需的時(shí)間內(nèi)，使用600 nm濾光片定期記錄光密度(OD)。使用制造商提供的軟件Easy Bioscreen Experiment記錄所有獲得的數(shù)據(jù)。然后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)出到Microsoft®Excel®Professional 2013工作表以供進(jìn)一步分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
使用Bioscreen C全自動(dòng)生長曲線分析儀優(yōu)化的環(huán)境篩選能夠快速比較不同配方在目標(biāo)生態(tài)位中的適應(yīng)能力。對(duì)于本研究中評(píng)估的三種配方，證明清酒假絲酵母菌CPA-1（BCA）在廣泛的環(huán)境條件下有效，在極端環(huán)境壓力條件下有一些限制。盡管流化床噴霧干燥制劑會(huì)導(dǎo)致一些細(xì)胞損傷，但它們似乎在干燥后顯示出有效的環(huán)境適應(yīng)能力。馬鈴薯淀粉配方能夠擴(kuò)展生態(tài)位范圍，尤其是對(duì)高溫的耐受性，這可能是由于在干燥過程中加入了可生物降解的涂層。
圖1、在優(yōu)化合成葡萄汁期間獲得的生長曲線，使用BioscreenC全自動(dòng)生長曲線分析儀測(cè)定清酒假絲酵母菌CPA-1在培養(yǎng)基中的生長曲線：a)用半固體培養(yǎng)基在不搖動(dòng)的情況下獲得的平均生長曲線（十個(gè)單獨(dú)的重復(fù)）；b)自動(dòng)讀數(shù)前20秒搖動(dòng)液體培養(yǎng)基獲得的平均生長曲線（10次重復(fù)）；c)用連續(xù)搖動(dòng)的液體培養(yǎng)基獲得的平均生長曲線（十個(gè)單獨(dú)的重復(fù)）；d使用液體介質(zhì)連續(xù)搖動(dòng)獲得的各個(gè)曲線，不同的虛線表示每種配方的不同濃度。
圖2、在優(yōu)化Bioscreen C全自動(dòng)生長曲線分析儀測(cè)定中使用的接種物大小期間獲得的初始濁度值。代表了三種配方：Candifruit（■）、馬鈴薯淀粉配方（實(shí)心三角形▲）和麥芽糖糊精配方(●)。每個(gè)配方的線性回歸用虛線表示。使用具有連續(xù)振蕩處理的液體SGJ介質(zhì)。數(shù)值是接種后前10分鐘內(nèi)每2分鐘記錄的五個(gè)讀數(shù)的平均值，每種制劑使用三個(gè)孔。
圖3、OD600和清酒假絲酵母菌（CFU ml-1）在不同生長時(shí)間與初始接種量為105 CFU ml-1之間的相關(guān)性。代表了三種配方：Candifruit（■）、馬鈴薯淀粉配方（實(shí)心三角形▲）和麥芽糖糊精配方(●)。功率趨勢(shì)線用虛線表示。使用連續(xù)搖動(dòng)的液體SGJ培養(yǎng)基。
圖4、每種測(cè)試配方的總結(jié)效果：Candifruit、馬鈴薯淀粉和麥芽糖糊精。三種研究配方表示為LogWorth百分比值，以比較模型中的效果：溫度（填充淺灰色方塊）、水分活度（填充灰色方塊）和pH值（填充黑色方塊）。
圖5、在每種評(píng)估條件（溫度、水分活度和pH值）下，清酒假絲酵母菌CPA-1實(shí)現(xiàn)生長的接種孔百分比的圖形表示。每張圖中表示三種配方：Candifruit（■）、馬鈴薯淀粉配方（實(shí)心三角形▲）和麥芽糖糊精配方(●)。對(duì)于每種處理和來源，由相同字母鏈接的百分比值沒有顯著差異（P<0.05)根據(jù)正交對(duì)比分析。不同的大寫字母表示相同條件（溫度、水分活度或pH）下清酒假絲酵母菌CPA-1制劑之間的顯著差異。不同的小寫字母表示同一配方內(nèi)不同評(píng)估溫度、水分活度或pH條件之間的顯著差異。
總結(jié)
生物防治微生物的環(huán)境適應(yīng)能力一直是開發(fā)有效制劑的主要瓶頸。清酒假絲酵母是一種有效的生物防治劑(BCA)，可對(duì)抗擴(kuò)張青霉、灰霉病菌或根霉，最近優(yōu)化了生物防治劑的不同配方。本研究使用Bioscreen C全自動(dòng)生長曲線分析儀比較生物防治劑清酒假絲酵母的不同干燥和液體制劑對(duì)相互作用的環(huán)境條件的相對(duì)耐受性。采用這種自動(dòng)化的濁度法對(duì)生物控制酵母的不同配方進(jìn)行了優(yōu)化。清酒假絲酵母菌CPA-1菌株在合成葡萄汁培養(yǎng)基中在連續(xù)搖動(dòng)下生長，初始濃度為105 CFUs ml-1，獲得了最好的生長曲線。所有配方都顯示出光密度值和酵母濃度之間的直接關(guān)系。當(dāng)溫度(15–30°C)和水分活度(aw;0.94–0.99)對(duì)酵母彈性的影響最大，而pH值(3–7)的影響最小。一般而言，液體配方在更多相互作用的環(huán)境條件下生長更快，但只有干馬鈴薯淀粉配方中的酵母細(xì)胞可以在某些壓力條件下生長。這種快速篩選方法可用于有效識(shí)別不同生物防治制劑在相互作用的生態(tài)非生物條件下的適應(yīng)能力。
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