2.7噬菌體ZX14的體外殺菌曲線
如圖6所示，細(xì)菌培養(yǎng)對照組(NC)OD值于0~90 min明顯增加，90~240 min進(jìn)入平臺期，OD值在1.6僅呈現(xiàn)微小波動(dòng)。噬菌體ZX14與陰溝腸桿菌2025在不同MOI下混合，OD值先輕微增加后逐漸減少，減少速度與噬菌體數(shù)量成正比。不論噬菌體的MOI為0.1、0.01、0.001，在4 h后OD值均降在0.1左右，陰溝腸桿菌2025數(shù)量顯著減少。
圖6噬菌體ZX14體外殺菌曲線
2.8噬菌體ZX14宿主譜測定
對污水中篩選出的21種桿菌進(jìn)行ZX14裂解性鑒定，結(jié)果顯示噬菌體ZX14在路德維希腸桿菌52-5H、神戶腸桿菌52-4H及陰溝腸桿菌52-3L的培養(yǎng)基平板上長出清晰噬菌斑，其余菌株的培養(yǎng)基平板未見長斑。表明噬菌體ZX14對52-5H、52-4H、52-3L具有裂解性，對其余18種桿菌無裂解性(表2)。
表2噬菌體ZX14宿主譜
2.9噬菌體ZX14比較基因組分析
2.9.1基因組圈圖分析
噬菌體ZX14基因組是一種雙鏈環(huán)狀DNA，全長173 679 bp，GC含量為39.92%，與陰溝腸桿菌噬菌體vB_EclM_Q7622親緣關(guān)系最為相近，覆蓋率(coverage)及相似度(identity)均達(dá)到96%以上。預(yù)測ZX14具有294個(gè)ORF。預(yù)測結(jié)果顯示，122個(gè)ORF與已知功能蛋白的基因相似(圖7)，其中，64個(gè)與DNA代謝有關(guān)，39個(gè)與噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白有關(guān)，3個(gè)與噬菌體裂解有關(guān)，2個(gè)與噬菌體包裝有關(guān)，剩余172個(gè)為假設(shè)蛋白(hypothetical protein)。
圖7噬菌體ZX14(綠色)與6種相似噬菌體基因組的可視化基因組圈圖
2.9.2同一性(ANI)分析
為了鑒定噬菌體ZX14與其他噬菌體基因組的相似性，首先在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示，有8株噬菌體的核苷酸序列與ZX14的覆蓋率高于70%，包括Q7622(96%coverage，96.62%identity;序列號:NC_070778.1)、305(91%coverage，95.44%identity;序列號:NC_070776.1)、IME523(91%coverage，95.50%identity;序列號:NC_070777.1)、Entb_45(88%coverage，94.70%identity;序列號:ON630910.1)、CIP9(90%coverage，94.63%identity;序列號:NC_048849.1)、ENC9(90%coverage，96.24%identity;序列號:OL355124.1)、PEi26(71%coverage，81.12%identity;序列號:AP014715.1)和PEi20(71%coverage，81.09%identity;序列號:NC_028683.1)，基于從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到的全基因組序列，計(jì)算ZX14與最相似的前9個(gè)噬菌體之間的平均核苷酸同一性ANI值，并制作噬菌體ZX14的基因組熱圖，如同一性值所示(圖8)，ZX14和腸桿菌噬菌體Q7622之間的ANI值最高，達(dá)到94.75%。
圖8噬菌體ZX14與9種相似噬菌體基因組ANI分析熱圖
2.9.3末端酶大亞基系統(tǒng)發(fā)育分析
為了分析噬菌體ZX14的進(jìn)化關(guān)系，對噬菌體ZX14進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹編輯和可視化?；贐LAST對比結(jié)果，利用編碼終止酶大亞基的氨基酸序列構(gòu)建噬菌體ZX14可視化系統(tǒng)發(fā)育樹(圖9)，并分析噬菌體的遺傳關(guān)系。對比的18種噬菌體分別屬于神奈川病毒屬(Kanagawavirus)、卡拉姆病毒屬(Karamvirus)、海爾德蘭病毒屬(Gelderlandvirus)、達(dá)卡病毒屬(Dhakavirus)和膠大病毒屬(Jiaodavirus)。其中，通過系統(tǒng)發(fā)育分析可以看出，ZX14與vB EclM Q7622等4種噬菌體同源性最高。vB EclM Q7622屬于斜波病毒科(Straboviridae)，特文病毒亞科(Tevenvirinae)，神奈川病毒屬(Kanagawavirus)。
圖9噬菌體ZX14末端酶大亞基系統(tǒng)發(fā)育樹
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