2方法
2.1不同濃度菌懸液的制備
取4株洋蔥伯克霍爾德菌劃線至TSA平板，置32.5℃培養(yǎng)24 h，配制成2.0左右麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳以?，備用；再用無菌生理鹽水稀釋至含量為每1 mL含101、102、103、104cfu的菌懸液，備用。
取5株非目標(biāo)菌劃線至TSA平板，置32.5℃培養(yǎng)24 h，再用無菌生理鹽水稀釋至含量為每1 mL含104cfu的菌懸液，備用。
2.2液體培養(yǎng)基的生長特性研究
取2.1項下4株洋蔥伯克霍爾德菌的101、102、103菌懸液1 mL接種至各液體培養(yǎng)基中，每種濃度每種培養(yǎng)基制備1管，置32.5℃培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果，必要時，劃線至TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)，以確認(rèn)是否有菌生長。
2.3慶大霉素對各試驗菌的最低抑菌濃度（MIC）測定
取1.4（2）慶大霉素溶液1 mL，用無菌TSB作為稀釋液，稀釋50倍至20μg/mL，再按二倍稀釋法，分別稀釋至10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/mL，制成裝量為10 mL的培養(yǎng)管，每個質(zhì)量濃度各平行制備3管，每管接種2.1項下4株洋蔥伯克霍爾德菌的菌懸原液各100μL，取無慶大霉素的TSB管接種相應(yīng)試驗菌作為陽性對照管，置32.5℃培養(yǎng)48～72 h，用肉眼觀察其渾濁度，并記錄渾濁管數(shù)。
2.4非目標(biāo)菌抑制試驗
按2.3項下制備的含0.625μg/mL慶大霉素的TSB管，分別接種2.1項下金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門氏菌及銅綠假單胞菌菌懸液各100μL，取無慶大霉素的TSB管接種相應(yīng)試驗菌做為陽性對照管，置32.5℃培養(yǎng)48～72 h，用肉眼觀察其渾濁度，并記錄渾濁管數(shù)。
2.5藥敏試驗
用無菌棉簽將4株洋蔥伯克霍爾德菌的TSA培養(yǎng)物挑取至相應(yīng)的鑒定肉湯中，配制成0.5～0.6麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?，每株試驗菌各?支藥敏肉湯，分別滴加1滴藥敏指示劑，再取已制備好的各試驗菌菌懸液25μL分別轉(zhuǎn)移至藥敏肉湯中，混勻，將鑒定肉湯和藥敏肉湯分別倒入鑒定/藥敏板中，依法上機測試。
3結(jié)果與分析
對比3種標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)體系，詳見表1，3種標(biāo)準(zhǔn)均采用了傳統(tǒng)的增菌后劃線分離的方法，但使用的培養(yǎng)基各有不同。
表1 3種洋蔥伯克霍爾德菌檢驗方法的培養(yǎng)基列表
3.1液體培養(yǎng)基生長特性研究
為了考察菌株A在各標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)體系中的生長情況，本研究選取了TSB、SCDLP+、BCSB+和MLET等4種液體培養(yǎng)基，以菌株A及3株洋蔥伯克霍爾德菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為試驗菌，開展生長特性研究。液體培養(yǎng)基生長特性研究結(jié)果表明，不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)菌株在各液體培養(yǎng)基中均生長良好，并無顯著性差別，詳見表2；但各濃度的菌株A在BCSB+中均無法生長，且在培養(yǎng)基SCDLP+、TSB和MLET中，也出現(xiàn)不同程度的生長緩慢情況，為進(jìn)一步探究菌株A在BCSB+中不生長的原因，對各培養(yǎng)基的成分表進(jìn)行分析，詳見表3。
表2液體培養(yǎng)基生長特性研究結(jié)果
各濃度的菌株A在BCSB+均不能生長，說明該培養(yǎng)基缺少該菌株生長必需的某種營養(yǎng)成分，或該培養(yǎng)基中有抑制菌株A生長的成分。葡萄糖、蔗糖、乳糖及牛肉膏等為培養(yǎng)物提供碳源，酪蛋白胰酶消化物、蛋白胨/大豆蛋白胨、大豆粉木瓜蛋白酶消化物和酵母提取物等為培養(yǎng)物提供氮源，氯化鈉維持滲透壓，酚紅為pH指示劑，結(jié)晶紫可抑制革蘭氏陽性菌及部分真菌生長，慶大霉素可抑制革蘭氏陰性菌及部分革蘭氏陽性菌生長。仔細(xì)分析表3不難發(fā)現(xiàn)，各培養(yǎng)基中的碳源、氮源及滲透壓調(diào)節(jié)劑基本一致，pH并無顯著性差別，可見BCSB+中并不缺少該菌株生長必需的某種營養(yǎng)成分，且菌株A為革蘭氏陰性菌。由此推斷，慶大霉素可能抑制了該菌的生長。
表3 3種檢驗方法涉及的液體培養(yǎng)基配方
3.2慶大霉素對各試驗菌的最低抑菌濃度（MIC）測定
由表4可知，3株標(biāo)準(zhǔn)菌株在含0.3125～20μg/mL慶大霉素的TSB中均生長良好，而菌株A在含1.25～20μg/mL慶大霉素的TSB中均無法生長，僅在含0.312 5～0.625μg/mL慶大霉素的TSB中可以生長，可見標(biāo)準(zhǔn)菌株對慶大霉素的耐受度較高，而菌株A對慶大霉素較敏感，所以慶大霉素對菌株A的MIC為0.625μg/mL，慶大霉素對3株標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC均大于20μg/mL。
表4慶大霉素對各試驗菌的MIC測定
3.3非目標(biāo)菌抑制試驗
慶大霉素作為抗生素添加劑添加至選擇性培養(yǎng)基中，是為了抑制非目標(biāo)菌的生長，從而提升目標(biāo)菌的檢出率。而慶大霉素是一種氨基糖苷類抗生素，主要用于治療細(xì)菌感染，尤其是革蘭氏陰性菌引起的感染，革蘭陽性菌中，金黃色葡萄球菌對本品敏感。故本次試驗選取了對慶大霉素相對敏感的4株非目標(biāo)菌，分別為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門氏菌及銅綠假單胞菌等作為試驗菌。實驗結(jié)果表明（表5）：該質(zhì)量濃度的慶大霉素能抑制一定程度的金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌，但無法抑制大腸埃希菌和沙門氏菌。如果將培養(yǎng)基配方中慶大霉素的含量降低至0.625μg/mL時，則不能達(dá)到抑制非目標(biāo)菌的效果。
表5非目標(biāo)菌抑制試驗
3.4藥敏試驗
由上文可知，洋蔥伯克霍爾德菌選擇性培養(yǎng)基中添加慶大霉素，會導(dǎo)致菌株A無法檢出，為了篩選出更多可以替代慶大霉素的抗生素添加劑，采用全自動微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)，取4株洋蔥伯克霍爾德菌TSA純培養(yǎng)物上機測試。該設(shè)備可完成試驗菌的鑒定以及各抗生素最低抑菌濃度的定量藥物敏感性測試，試驗結(jié)果見表6，慶大霉素對4株洋蔥伯克霍爾菌的測試值與上文中MIC測試結(jié)果基本一致，3株標(biāo)準(zhǔn)菌株大于藥敏板上限值（8μg/mL），菌株A低于藥敏板下限值（2μg/mL）。另外，當(dāng)4株菌的某種抗生素測試值均大于其上限值時，說明目標(biāo)菌對這種抗生素的耐受度較高，有應(yīng)用于化妝品中洋蔥伯克霍爾菌的檢測方法的可能性，符合條件的抗生素分別為頭孢唑林、氨芐青霉素及四環(huán)素等。
表6藥敏試驗結(jié)果μg·mL-1
4結(jié)束語
洋蔥伯克霍爾德菌是洋蔥伯克霍爾德菌菌群中最常見的菌株之一，該菌群有20余種，菌株A對慶大霉素非常敏感，但3株標(biāo)準(zhǔn)菌株耐受度較高，可見該菌群內(nèi)各菌株生長特性各異?；诖?，本研究對化妝品中洋蔥伯克霍爾德菌的檢驗方法提出幾點改進(jìn)建議。
首先應(yīng)優(yōu)化添加抗生素的種類及質(zhì)量濃度，頭孢唑林、氨芐青霉素及四環(huán)素等均可作為慶大霉素抗生素的替代品，但具體添加質(zhì)量濃度還有待于進(jìn)一步試驗研究；另外李詩瑤等在沙門氏菌的定性檢驗時，采用了多種選擇性平板進(jìn)行劃線分離，顯著提高檢出率。王似錦等在對凝膠劑中1株洋蔥伯克霍爾德菌的生長特性研究結(jié)果表明，該菌在選擇性培養(yǎng)基麥康凱瓊脂和紫紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基中也生長良好。可見在化妝品中洋蔥伯克霍爾德菌的檢驗方法中，也可聯(lián)用多種選擇性平板作為劃線分離平板，在兼顧選擇性及目標(biāo)菌生長特性的同時，提升檢出率。
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