摘要
評(píng)估了脈沖光和熱處理對(duì)枯草芽孢桿菌孢子的聯(lián)合滅活效果。分別應(yīng)用這些過(guò)程，并修改兩次治療之間的時(shí)間，以評(píng)估第一次治療的效果是否能保持很長(zhǎng)時(shí)間。B、經(jīng)過(guò)亞致死預(yù)處理的枯草芽孢比未經(jīng)處理的芽孢對(duì)后續(xù)處理（PL或熱處理）更敏感。在減少枯草芽孢桿菌數(shù)量方面，加熱后的PL是最有效的組合。無(wú)論溫度是（4°C還是30°C），細(xì)菌孢子在水中儲(chǔ)存至少24小時(shí)后仍對(duì)后續(xù)處理敏感?？莶菅挎邨U菌細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)肉湯中萌發(fā)后對(duì)PL或熱處理的敏感性增加，在3到24小時(shí)內(nèi)同樣敏感。營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在孢子萌發(fā)后對(duì)后續(xù)處理保持增強(qiáng)的敏感性。這項(xiàng)工作的結(jié)果表明，加熱和光致發(fā)光處理相結(jié)合是一種很有前途的微生物滅活保存方法。
1、引言
芽孢桿菌屬的孢子形成細(xì)菌在環(huán)境中廣泛存在，可以從用于食品生產(chǎn)的各種食品和配料中分離出來(lái)（Carlin，2011；Kramer和Gilbert，1989）。這些微生物形態(tài)對(duì)許多脅迫具有極強(qiáng)的抵抗力，包括有毒化學(xué)品和生物殺滅劑、干燥、高壓、熱處理、紫外線處理或電離輻射（Nicholson等人，2000年；Setlow，2006年）。雖然休眠孢子本身并不構(gòu)成危害，但芽孢桿菌和其他密切相關(guān)物種的生長(zhǎng)生物體與食物腐敗甚至嚴(yán)重的食源性疾病有關(guān)（Setlow，2006）。熱殺菌是一種有效的滅活細(xì)菌孢子的過(guò)程，但在食品中使用高溫可能會(huì)導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)、感官或技術(shù)特性發(fā)生重大變化。因此，人們大力開(kāi)發(fā)非熱技術(shù)，以防止不利的熱效應(yīng)，生產(chǎn)安全的食品。
脈沖光（PL）技術(shù)是傳統(tǒng)熱去污和化學(xué)去污工藝的替代品，可在不影響產(chǎn)品質(zhì)量的情況下提高食品安全性。該技術(shù)包括連續(xù)重復(fù)寬帶發(fā)射光（190–1000 nm）的短時(shí)高功率閃爍，約40%的發(fā)射光對(duì)應(yīng)于UV區(qū)域（Wekhof，2000）。
PL已成功測(cè)試了不同微生物的失活，包括營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞（Artíguez和Martínez de Mara?ón，2015b；Gómez-López等人，2005）和孢子（Artíguez和Martínez de Mara?n，2015ab；Dunn等人，1989；Levy等人，2012）。然而，其在液體食品處理中的應(yīng)用受到其成分、不透明度或濁度的限制，這決定了微生物暴露在入射光下（Artíguez等人，2012；Hsu和Moraru，2011），因此也決定了處理效果。通過(guò)與其他新興技術(shù)或更溫和的傳統(tǒng)保存方法相結(jié)合，可以提高PL對(duì)復(fù)雜食品基質(zhì)中微生物的滅活效果。在這方面，最近進(jìn)行了一些研究，以檢驗(yàn)光致發(fā)光處理與其他技術(shù)相結(jié)合的有效性，如脈沖電場(chǎng)（Mu?oz等人，2012；Palgan等人，2011）、熱超聲（Mu?oz等人，2011a，b）、壓力熱超聲（Palgan等人，2011）超聲波或乳鏈菌肽或乳酸的亞致死濃度（Mu?oz等人，2012）。類似地，如其他滅活技術(shù)所述，適度的處理溫度可以提高PL處理效率（Geveke，2008；Jayaram等人，1992）。然而，光致發(fā)光處理與溫和熱處理相結(jié)合對(duì)微生物失活的影響，特別是對(duì)細(xì)菌孢子減少的影響尚未得到解決。
因此，本研究的主要目的是評(píng)估連續(xù)應(yīng)用光照和熱處理對(duì)枯草芽孢桿菌孢子失活的影響。為此目的，確定了亞致死光致發(fā)光預(yù)處理對(duì)孢子耐熱性的影響，以及在先前加熱或光致發(fā)光處理后對(duì)光致發(fā)光處理的后續(xù)敏感性，以及它們?cè)诓煌瑮l件下儲(chǔ)存期間的持久性。B、枯草桿菌被用作挑戰(zhàn)微生物，因?yàn)樗驯粡V泛研究作為其他孢子形成物的替代物，并且對(duì)各種物理和化學(xué)處理具有高度抗性（Nicholson等人，2000）。
2、材料和方法
2.1.菌株和孢子產(chǎn)生
B、枯草桿菌DSM 10（德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物收藏，德國(guó)布倫瑞克）在-80°C的胰蛋白酶大豆肉湯（TSB，Pronadisa，Madrid，Spain）中保存，并添加20%（w/w）甘油溶液。將解凍的儲(chǔ)備培養(yǎng)物（100μL）轉(zhuǎn)移到10 mL TSB中，并在30°C下預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)。然后將細(xì)菌菌株以103 CFU/mL接種，并在30°C下培養(yǎng)24小時(shí)，直到早期穩(wěn)定生長(zhǎng)階段（107 CFU/mL）。將500μL的小份細(xì)菌培養(yǎng)物攤鋪在營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA，Pronadisa，Madrid，Spain）上，并添加1 mg/L MnSO4和0.5 g/L CaCl2（Prentice等人，1972），然后在30°C下培養(yǎng)5-7天，直到90%的細(xì)胞形成孢子。通過(guò)使用相差顯微鏡觀察不可折射孢子，并通過(guò)比較加熱（70°C，10分鐘）和未加熱孢子懸浮液的計(jì)數(shù)來(lái)驗(yàn)證孢子形成。用無(wú)菌蒸餾水從瓊脂平板上收集孢子。收集的孢子在4°C下以4000×g離心15分鐘，并用無(wú)菌蒸餾水洗滌三次。實(shí)驗(yàn)是用獨(dú)立制備的孢子懸浮液進(jìn)行的。
2.2.聯(lián)合治療
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖如圖1所示。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以評(píng)估PL預(yù)處理（0.5或1 J/cm2）對(duì)枯草桿菌孢子對(duì)隨后加熱（90°C，10分鐘）或PL處理（0.5 J/cm2）的耐受性的影響，以及對(duì)閾下熱處理（90°C：5、10、15或20分鐘）后PL處理的耐受性的影響。樣品預(yù)處理后，立即對(duì)孢子懸浮液進(jìn)行第二次處理，或?qū)⑵鋺腋≡谡麴s水或TSB中，并在4或30°C下儲(chǔ)存不同的時(shí)間間隔，然后進(jìn)行進(jìn)一步處理。當(dāng)孢子懸浮在TSB中時(shí)，通過(guò)在4°C下以10000×g離心10分鐘的方式洗滌細(xì)胞兩次，并在第二次處理之前在蒸餾水中重新懸浮。將聯(lián)合處理后的枯草桿菌孢子的可培養(yǎng)性與未經(jīng)后續(xù)處理（預(yù)處理對(duì)照）的預(yù)先處理的孢子和未經(jīng)預(yù)處理（處理對(duì)照）的孵化并提交第二次處理的孢子的可培養(yǎng)性進(jìn)行比較。每個(gè)條件治療至少重復(fù)三次。未經(jīng)處理的接種樣本用作對(duì)照。
圖1。PL和加熱聯(lián)合處理以滅活枯草桿菌孢子的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。
2.2.1.脈沖光處理
使用了臺(tái)式SBS XeMaticA-（L hL）設(shè)備（SteriBeam Systems GmbH，Kehl，Germany）。拋光不銹鋼處理反應(yīng)器由一個(gè)垂直移動(dòng)的石英架組成，用于在兩個(gè)氙燈（上部和下部）之間放置樣品。發(fā)射光譜包括190至1000 nm的波長(zhǎng)，約20%的發(fā)射光在UV-C中，8%在UV-B中，12%在UV-A區(qū)域（Wekhof，2000）。風(fēng)扇冷卻系統(tǒng)用于防止燈具和樣品過(guò)熱。
將等分的300μL或枯草桿菌孢子懸浮液（如上所述制備）轉(zhuǎn)移到無(wú)菌紫外線透明的超硅石英反應(yīng)杯（體積300μL，光學(xué)長(zhǎng)度1 mm，德國(guó)繆爾海姆Hellma）中，并立即在室溫（23–25°C）下進(jìn)行光致發(fā)光處理。將樣品放置在距離上氙燈6 cm處的石英架中心，并在2.2 kV下處理。光致發(fā)光處理僅使用上部氙燈。
使用能量計(jì)（型號(hào)QE25-LP-H-MB，加拿大魁北克Gentec）和Solo2讀出裝置測(cè)量每個(gè)脈沖的注量，單位為焦耳/平方厘米（J/cm2）（Artíguez等人，2012）。允許測(cè)量之間至少暫停30秒，以防止探測(cè)器可能過(guò)熱。所有注量測(cè)量均一式三份。
總通量（H）或單位面積照射在樣品上的光子量是影響光致發(fā)光滅活微生物的最相關(guān)過(guò)程因素（Artíguez和Martínez de Mara?ón，2014；Lasagabaster和Martínez de Mara?ón，2013）。因此，總注量是通過(guò)將脈沖注量乘以發(fā)射光脈沖數(shù)（n）（H HEH0 x n）來(lái)計(jì)算的。樣品暴露在0.14-12J/cm2的注量范圍內(nèi)。每個(gè)條件治療至少重復(fù)三次。未經(jīng)處理的接種樣本用作對(duì)照。
2.2.2.熱處理
熱處理在帶有硅膠隔膜的螺旋蓋玻璃管中進(jìn)行（Sigma，Aldrich，西班牙馬德里）。將含有2.7 mL蒸餾水的試管浸入油恒溫槽（PolyStat 37，F(xiàn)isher Scientific，Leicestershire，UK）中，并預(yù)熱至90°C。將k型熱電偶（T1光纖溫度探頭，加拿大Neoptix）插入未接種的試管中，并用于控制溫度。將試管平衡至適當(dāng)溫度后，使用1 mL注射器將等分的300μL枯草桿菌孢子懸浮液注射到試管中（Hamilton，Bonaduz，Switzerland）。在預(yù)定的暴露時(shí)間間隔（5、10、15或20分鐘）后，將加熱管從恒溫槽中取出，并立即放置在冰槽中。在幸存者計(jì)數(shù)之前，試管一直保存在冰中。
2.3.孢子萌發(fā)和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)試驗(yàn)
通過(guò)使用Bioscreen C分析儀系統(tǒng)（英國(guó)貝辛斯托克Labsystems）在600 nm（OD600）處測(cè)量光密度來(lái)監(jiān)測(cè)孢子萌發(fā)和隨后的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程。將含有300μl TSB的每個(gè)微孔板接種30μl孢子懸浮液，初始OD600為1.0。微孔板在30°C下孵化，每5分鐘監(jiān)測(cè)一次每個(gè)微孔板孔的OD600。在4°C下未測(cè)定孢子萌發(fā)，因?yàn)樵摐囟瘸隽吮竟ぷ髦惺褂玫脑O(shè)備的工作范圍。為了防止孢子沉降，在每次測(cè)量之前將微孔板搖晃10秒。在每次分析中，分別進(jìn)行三個(gè)重復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)了三次。發(fā)芽程度表示為初始OD600的分?jǐn)?shù)（t時(shí)的OD600/初始OD600）?？莶菅挎邨U菌孢子的萌發(fā)通過(guò)相位對(duì)比顯微鏡直接觀察得到證實(shí)。
2.4.微生物分析
每次處理后立即測(cè)定接種的未處理（對(duì)照）和處理樣品中的枯草桿菌孢子數(shù)。液體樣品在1%緩沖蛋白胨水中連續(xù)稀釋（西班牙馬德里Pronadisa），并將0.1 mL適當(dāng)稀釋液表面鍍?cè)谝鹊鞍酌复蠖弓傊ㄎ靼嘌礼R德里Pronadisa TSA）上。將皮氏培養(yǎng)皿在30°C下培養(yǎng)72小時(shí)后，計(jì)數(shù)枯草桿菌菌落，結(jié)果以對(duì)數(shù)CFU/mL表示。將平板在30°C下再放置7天，以驗(yàn)證不再出現(xiàn)CFU。
方差分析和Tukey的誠(chéng)實(shí)顯著差異檢驗(yàn)用于確定治療之間的顯著差異（pb 0.05）（SPSS Inc.，IL，美國(guó)）。
結(jié)果和討論
3.1.PL處理后熱處理對(duì)枯草桿菌孢子滅活的影響
評(píng)估了PL隨后進(jìn)行亞致死熱處理對(duì)枯草桿菌孢子失活的影響。單獨(dú)暴露于90°C下的熱處理10分鐘或總通量為0.5或1 J/cm2時(shí)，枯草桿菌孢子數(shù)分別減少0.6、1.1和2.7 Log（圖2）。然而，當(dāng)枯草桿菌孢子經(jīng)過(guò)PL（0.5和1 J/cm2）和加熱（90°C，10分鐘）后，對(duì)數(shù)減少了2.4和4.6。光致發(fā)光預(yù)處理強(qiáng)度越高，對(duì)熱處理的敏感性越高。ANOVA測(cè)試表明，在經(jīng)過(guò)加熱的PL處理后的孢子失活與單獨(dú)處理的失活效果總和之間存在顯著差異（數(shù)據(jù)未顯示），顯示出協(xié)同效應(yīng)。
圖2。未經(jīng)處理的枯草桿菌孢子的存活率（C），在0.5 J/cm2的PL處理（PL（0.5））、1 J/cm2的PL處理（PL（1））、熱處理（TT）（90°C，10分鐘）、0.5 J/cm2的PL處理后，再進(jìn)行TT（PL（0.5）+TT）或1 J/cm2的PL處理后，再進(jìn)行TT（PL（1）+TT。誤差線表示95%水平的置信區(qū)間。
上述結(jié)果表明，根據(jù)先前報(bào)告的結(jié)果（Artíguez和Martínez de Mara?ón，2015a），PL預(yù)處理將使細(xì)菌孢子對(duì)隨后的熱失活敏感。
有幾個(gè)原因可以歸因于PL預(yù)處理后對(duì)熱處理的敏感性增加。如前所示，在PL處理后存活的細(xì)胞可能具有亞致死損傷（Rajkovic等人，2009；Wuytack等人，2003），這將使它們對(duì)隨后的最小熱處理更敏感。PL技術(shù)的抗菌作用主要?dú)w因于DNA損傷（Takeshita等人，2003）和其他結(jié)構(gòu)修飾，如枯草桿菌孢子的變形或解體（Wekhof等人，2001）。PL處理和熱處理對(duì)不同細(xì)胞功能的互補(bǔ)作用可能是亞致死PL處理后枯草桿菌孢子熱敏感性增強(qiáng)的原因。另一方面，隨后的熱處理也可以抑制或降低修復(fù)先前PL處理引起的損傷的能力（例如，DNA修復(fù)機(jī)制），從而提高該序列處理的抗菌效果。
3.2.枯草芽孢桿菌孢子在30°C或4°C儲(chǔ)存期間經(jīng)過(guò)亞致死PL預(yù)處理后的熱敏感性
亞致死處理后存活的孢子對(duì)應(yīng)激的敏感性可以通過(guò)評(píng)估其萌發(fā)和隨后的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)來(lái)檢查（Fernández等人，2001年；Melt等人，2008年）。在600 nm（OD600）處測(cè)量孢子懸浮液的光密度可以監(jiān)測(cè)萌發(fā)和隨后的生長(zhǎng)過(guò)程（Smelt等人，2008年）。如圖3所示，在促進(jìn)孢子萌發(fā)和生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（TSB）中培養(yǎng)表明，低強(qiáng)度光照處理（0.5 J/cm2）對(duì)孢子萌發(fā)沒(méi)有影響，因?yàn)楣庹疹A(yù)處理孢子的OD600減少與未處理孢子沒(méi)有差異。雖然暴露于0.5 J/cm2后發(fā)芽率沒(méi)有受到影響，但與未處理的孢子相比，枯草桿菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)（OD600增加）延遲了約1小時(shí)（圖3）。B、枯草桿菌孢子在沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的水中懸浮24小時(shí)后沒(méi)有萌發(fā)，未經(jīng)處理和PL處理的樣品之間沒(méi)有差異。
圖3?？莶菅挎邨U菌孢子萌發(fā)和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的比較：TSB中未經(jīng)處理的孢子（對(duì)照）(?),在水中暴露于0.5 J/cm2的PL預(yù)處理的孢子，隨后在TSB中孵化（…）以及未經(jīng)處理的孢子或在水中暴露于0.5 J/cm2的PL預(yù)處理并隨后在水中孵化的孢子（…）。在30°C下，通過(guò)OD600的變化測(cè)量發(fā)芽和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。
相關(guān)新聞推薦
1、氨基酸類營(yíng)養(yǎng)對(duì)微生物生長(zhǎng)及活性的影響
2、Bioscreen生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用于病毒的相關(guān)篩選試驗(yàn)：篩選94個(gè)噬菌體R1-RT的HPUFs
3、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基物化特性及其固態(tài)發(fā)酵新工藝的研究