吉林省是我國玉米生產(chǎn)大省，玉米深加工技術(shù)在延長產(chǎn)業(yè)鏈、優(yōu)化產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)、增加產(chǎn)品附加值方面發(fā)揮著重要作用，是解決三農(nóng)問題的一個重要措施。玉米淀粉的生產(chǎn)是玉米深加工的一個重要方面，其生產(chǎn)過程中所產(chǎn)生的玉米黃漿也含有多種可溶性蛋白、生長素和一些前體物質(zhì)。本課題組篩得一株能夠在以玉米淀粉、玉米黃漿為碳、氮源的培養(yǎng)基上繁殖并產(chǎn)β-1,3葡聚糖酶和多糖的羅耳阿太菌(AtheliarolfsiiAY6657741)。
羅耳阿太菌多糖(Atheliarolfsiiexopolysaccharides)是由羅耳阿太菌(Atheliarolfsii)發(fā)酵產(chǎn)生的一種胞外多糖，多糖的主鏈由D-吡喃葡萄糖以β-1,3糖苷鍵連接而成，因其具有免疫調(diào)節(jié)、降低膽固醇、降血糖等生理活性，受到了科研工作者的廣泛關(guān)注。β-1,3葡聚糖酶廣泛存在于動物、植物、微生物中，能夠特異性地作用于以β-1,3糖苷鍵連接的多糖聚合體，這一特性賦予該酶水解真菌細(xì)胞壁的能力，使它不但在啤酒生產(chǎn)、果酒釀造以及食品保鮮等行業(yè)中具有重要應(yīng)用，而且在糧食作物病蟲害防治領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
為獲得羅耳阿太菌β-1，3葡聚糖酶和胞外多糖同時高產(chǎn)的發(fā)酵條件，以玉米淀粉和玉米黃漿作為發(fā)酵培養(yǎng)基的重要組分，以羅耳阿太菌β-1,3葡聚糖酶產(chǎn)量和胞外多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，選擇培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、搖床轉(zhuǎn)速為優(yōu)化因素，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面試驗進(jìn)行雙響應(yīng)值優(yōu)化，對所得結(jié)果的三維圖和等高線疊加圖進(jìn)行分析，獲得了雙指標(biāo)同時達(dá)到最優(yōu)的發(fā)酵條件。結(jié)果表明：接種量5%、培養(yǎng)溫度28.5℃、培養(yǎng)時間7.5 d、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min時，粗酶產(chǎn)量39.96 U/mL，多糖產(chǎn)量18.11 g/L，分別達(dá)到了預(yù)測值的98.96%和99.27%。
原料
羅耳阿太菌(AtheliarolfsiiAY6657741)由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程實驗室分離純化并石蠟封存。
玉米淀粉：市售；玉米黃漿：黃龍食品有限公司，pH 4.16，蛋白含量4.2 g/L。
試驗試劑
PDA培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂15～20，自然pH。羅耳阿太菌發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米黃漿5%(V/V)，玉米淀粉30，K2HPO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，NaNO33.0，檸檬酸0.5，pH為4.5。SDS-PAGE試劑盒。Tris-Gly電極緩沖液(g/L)：Tris 14.4，甘氨酸3(變性另加SDS 1)?？捡R斯亮藍(lán)染色液：50%(V/V)甲醇，0.2%(m/V)考馬斯亮藍(lán)R-250，10%(V/V)乙酸，40%(V/V)H2O?？捡R斯亮藍(lán)脫色液：20%(V/V)甲醇，20%(V/V)乙酸，60%(V/V)H2O。孵育液：100 mL醋酸鉀(50 mmol/L，pH 5.5)溶液中含0.1 g昆布多糖。顯色液：200 mL NaOH(1.0 mol/L)中含0.3 g 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)。DNS：稱取6.5 g 3,5-二硝基水楊酸溶于少量水中，移入1 000 mL容量瓶，加入325 mL 2 mol/L NaOH溶液，再加入45 g丙三醇，搖勻，冷卻后定容至1 000 mL。海帶多糖、羅耳阿太菌多糖及透析袋(截留相對分子質(zhì)量為6 000～8 000)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
發(fā)酵培養(yǎng)的單因素試驗結(jié)果
發(fā)酵培養(yǎng)羅耳阿太菌生產(chǎn)多糖和酶的單因素試驗結(jié)果如圖1所示。
由圖1a可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，多糖和酶產(chǎn)量都有所提高，當(dāng)溫度達(dá)到30℃時，二者產(chǎn)量幾乎同時達(dá)到最大值。隨著溫度繼續(xù)上升，二者產(chǎn)量反而下降，這可能是由于溫度過高不利于羅耳阿太菌的生長，影響了酶和多糖的合成。
由圖1b可知，在發(fā)酵7 d時，多糖的產(chǎn)量最高，繼續(xù)延長發(fā)酵時間，多糖產(chǎn)量下降，這可能是由于在發(fā)酵中后期，培養(yǎng)液中的碳源幾乎耗盡，由β-1,3葡聚糖酶作用的可逆反應(yīng)開始向逆反應(yīng)方向進(jìn)行，酶催化多糖的水解致使多糖產(chǎn)量下降。也正是如此，這一作用開始促進(jìn)微生物對酶的積累，在發(fā)酵進(jìn)行的第8天，酶的產(chǎn)量達(dá)到一個高峰，但后期營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，菌體生長進(jìn)入衰亡期，使代謝產(chǎn)物酶的產(chǎn)量急劇下降。
由圖1c可知，在搖床轉(zhuǎn)速為175 r/min時，多糖和酶產(chǎn)量均達(dá)到峰值。這是由于適當(dāng)?shù)恼袷帟黾泳w與發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)的接觸面積，有助于菌株的生長，因此隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，2個指標(biāo)都呈現(xiàn)上升的趨勢，當(dāng)轉(zhuǎn)速高于175 r/min后，繼續(xù)提高轉(zhuǎn)速反而會導(dǎo)致指標(biāo)產(chǎn)量下降，這可能是由于過高的轉(zhuǎn)速導(dǎo)致剪切力變大，從而影響多糖和酶穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的形成，致使二者產(chǎn)量下降。
圖1培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量對粗酶和多糖產(chǎn)量的影響
由圖1d可知，裝液量不同時，2個指標(biāo)的產(chǎn)量雖有輕微波動，但都趨于平穩(wěn)，這可能是由于溶氧率對該菌種的生長無顯著影響，因此，不選擇裝液量作為響應(yīng)面的分析因素。
響應(yīng)面法雙指標(biāo)優(yōu)化最佳發(fā)酵工藝條件
Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果分析
根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、搖床轉(zhuǎn)速作為Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計的3個因素開展試驗，雙指標(biāo)優(yōu)化最佳發(fā)酵條件的響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。
表1 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果
雙指標(biāo)響應(yīng)值所得回歸模型函數(shù)表達(dá)式：
粗酶產(chǎn)量=-305.22+7.96X1+27.01X2+1.45X3+0.24X1X2-7.10E-003X1X3-0.04X2X3-0.15X12-1.76X22-2.64E-003X32(R2=0.982 7)
多糖產(chǎn)量=-58.45+1.48X1+10.72X2+0.18X3-0.02X1X2+2.8E-004X1X3-1.4E-003X2X3-0.02X12-0.67X22-4.92E-004X32(R2=0.987 2)
以上2個方程的R2值都接近于1，說明通過二次回歸得到的多糖及粗酶產(chǎn)量的模型與試驗擬合較好，可靠性高。
結(jié)論
利用玉米淀粉和玉米黃漿為培養(yǎng)基，成功培養(yǎng)出產(chǎn)羅耳阿太菌胞外多糖和β-1,3葡聚糖酶的羅耳阿太菌，最優(yōu)發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度28.5℃，培養(yǎng)時間7.5 d，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，多糖產(chǎn)量18.11 g/L，粗酶產(chǎn)量9.96 U/mL。
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