萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一種綠色藻類譜系的單細胞綠藻，具有高細胞分裂率，是研究藻類生物學最發(fā)達的參考生物之一。萊茵衣藻還可以在條件簡單的培養(yǎng)基中生長到高細胞密度，并且很容易通過各種方式使其出現(xiàn)金屬過量或超載的情況，再通過監(jiān)測某些金屬相關(guān)基因的表達來評估其生長狀況。萊茵衣藻能夠通過胞內(nèi)的重金屬結(jié)合因子降低重金屬對細胞的毒害，包括植物螯合肽、硫氧還蛋白、谷胱甘肽等大分子物質(zhì)。此外，銅的毒性作用通常被認為是通過產(chǎn)生活性氧對細胞造成損害，而萊茵衣藻能夠通過抗氧化物質(zhì)抵御這樣的損害。目前，對于萊茵衣藻富集重金屬的途徑以及相關(guān)的調(diào)控方法等方面并未完全弄清楚，特別是對重金屬抗性相關(guān)的蛋白和調(diào)控機制的分析在國內(nèi)的研究還比較少見。
在基因組學研究不斷進步的當下，萊茵衣藻作為模式生物被廣泛應用于轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建新的突變品種。通過篩選突變株進一步鑒定與重金屬抗性有關(guān)的基因成為研究衣藻重金屬抗性的一個有效方法。
Aida基因突變型萊茵衣藻對水溶液中銅離子耐受性及吸附效率鑒定方法，包括以下步驟：
(1)衣藻在Cu2+脅迫下的生長狀態(tài)：
按照衣藻細胞的培養(yǎng)方法，從新鮮的TAP平板上挑取野生型、突變體，將細胞培養(yǎng)到S1代。
在超凈工作臺內(nèi)取樣計數(shù)，然后用滅過菌的50mL離心管2500rpm，離心3min。將所有的細胞收集，用新鮮的TAP培養(yǎng)基重懸成濃度為1×108cell/mL的細胞懸液。
將滅過菌的0.1M的Cu2+溶液分別添加0、200、400、600、800、1000μL到吹氣瓶中，在吹氣瓶中加入2mL濃度為1×108cell/mL的細胞懸液。然后用新鮮的TAP液體培養(yǎng)基將每個吹氣瓶中的液體補齊到200mL，獲得分別用0、100、200、300、400、500μM Cu2+TAP培養(yǎng)基處理的衣藻細胞。
將處理好的細胞放置在光照培養(yǎng)箱內(nèi)光周期培養(yǎng)，然后按1、2、3、4天的時間點取樣計數(shù)，繪制生長曲線，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，發(fā)現(xiàn)Aida基因突變型萊茵衣藻具有高生長速率，且具有較高的銅離子耐受性；野生型WT藻株生長速率較慢，且容易受到銅離子的生長抑制作用。
(2)Cu2+吸附效率測定：
按照衣藻細胞的培養(yǎng)方法，從新鮮的TAP平板上挑取野生型、突變體，將細胞培養(yǎng)到S1代。在超凈工作臺內(nèi)取樣計數(shù)，然后用滅過菌的50mL離心管2500rpm，離心3min。將所有的細胞收集，用純水清洗3遍，每次2500rpm，離心3min。最終用純水調(diào)成濃度為1×107cell/mL的細胞懸液。
設(shè)定不同的吸附時間長度(0.25、0.5、1、2、3、4h)。將對應吸附時間點的樣本分別轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，6000g室溫離心1min取上清，并做好標記。將上述樣品加入新的24孔板中，對金屬液濃度超過75μM的樣品進行稀釋，再按照國標法加入對應試劑等待顯色完成，然后用酶標儀檢測OD457的吸光值。將酶標儀測定的吸光值代入標準曲線中，獲得不同上清樣品Cu2+濃度數(shù)據(jù)，將獲得數(shù)據(jù)導入GraphPad軟件，繪制統(tǒng)計圖，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，Aida基因突變型萊茵衣藻在同等吸附時間和銅離子濃度條件下，比野生型WT藻株具有更高的吸附效率。
總之，本發(fā)明依托于萊茵衣藻的野生型細胞株，從萊茵衣藻野生型細胞株構(gòu)建的隨機突變體文庫中經(jīng)銅離子耐受性細胞篩選及基因鑒定，鑒定獲得了具有銅離子耐受功能調(diào)控的基因Aida，該基因突變后導致衣藻細胞株的銅離子脅迫下的生物量增加顯著并且具有提高的銅離子吸附效率。