2結果
2.1苯酚降解菌的馴化、篩選與分離
篩選出4株能以苯酚為唯一碳源生長的菌株，且對苯酚的耐受濃度均能達到1 500mg/L，分別命名為Y_1、Y_2、Y_3和Y_4。將4株菌在同一條件下培養(yǎng)：苯酚濃度800 mg/L、pH 7.2、接種量4%、溫度32℃、搖床轉速180 r/min，振蕩培養(yǎng)30 h取樣測定培養(yǎng)基苯酚濃度。4株菌對苯酚的降解情況見圖1。由此可見，菌株Y_1的生長情況和降酚能力優(yōu)于其他菌株。
圖1 4株菌降酚情況
2.2菌株的初步鑒定
2.2.1形態(tài)學觀察
如圖2所示，菌株Y_1形成的菌落呈圓形，不透明，表面隆起、濕潤、光滑，邊緣整齊，顏色為乳白色，不可在平板上滑動。菌株革蘭氏染色呈陽性，細胞呈桿狀，有莢膜，有芽孢，有鞭毛。
圖2在平板上的生長情況
2.2.2生理生化鑒定
對菌株Y_1進行生理生化實驗鑒定，結果見下表。菌株可以分解葡萄糖和麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，V-P反應結果為陽性，甲基紅和吲哚實驗結果為陰性。對比《伯杰氏細菌鑒定手冊》[35]關于細菌的描述，菌株Y_1生理生化鑒定的結果基本符合芽孢桿菌的特征，再結合其形態(tài)學觀察的結果，可以初步將該菌株確定為芽孢桿菌屬(Bacillus)。
表菌株Y_1的生理生化特征
2.3 16S rDNA分析
2.3.1 PCR擴增結果
以菌株Y_1基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增后得到一條約為1.5 Kb的DNA片段。電泳檢測結果如圖3所示，在約1 500 bp處有一清晰的條帶，符合預期結果。
圖3電泳檢測結果
2.3.2系統(tǒng)進化樹分析
測序后發(fā)現(xiàn)菌株Y_1的核苷酸序列共有1434 bp，符合預期。通過同源性比對可以發(fā)現(xiàn)，菌株Y_1與芽孢桿菌屬相似度最高，選擇了在種屬水平最接近的19株菌，通過MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。由圖可知，菌株Y_1與蠟樣芽孢桿菌(登錄號：CP011153.1)的同源性高達99%，與蘇云金芽孢桿菌(登錄號：CP021061.1、CP015250.1、CP015176.1、CM000747.1、017208.1)也具有99%的同源性。結合其形態(tài)學觀察和生理生化鑒定的結果，可以將菌株Y_1確認為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)。
2.4生長曲線的測定
對菌株Y_1的生長情況做了測定，由圖5可知，當菌株培養(yǎng)8 h后進入對數(shù)生長期，在20h以后處于穩(wěn)定生長階段。在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)10h，當OD≈0.8時，菌種處于對數(shù)生長期初期，離心分離菌體制成種子液，用于后續(xù)苯酚降解實驗。
圖5菌株Y_1生長曲線
2.5菌株的降酚特性
2.5.1苯酚濃度標準曲線的繪制
以苯酚濃度為橫坐標，以吸光度(λ=510)為縱坐標，繪制苯酚濃度標準曲線。如圖6所示。該苯酚濃度標準曲線表明，當波長等于510 nm時，苯酚濃度范圍在2～20 mg/L之間，吸光度值Y和苯酚濃度X，滿足線性方程Y=0.1456X+0.0089，R2=0.9996，表明二者呈良好的線性關系。
圖6苯酚濃度標準曲線
2.5.2苯酚降解曲線
每6個小時取樣培養(yǎng)液，測定剩余的苯酚濃度。以培養(yǎng)時間為橫坐標，剩余苯酚濃度為縱坐標，繪制苯酚降解曲線。如圖7所示，結果表明：培養(yǎng)時間越長，苯酚濃度越低，降解率隨之升高。培養(yǎng)到42h時，剩余苯酚濃度為104mg/L，苯酚降解率高達90.5%，說明菌株Y_1具有較強的降酚能力，達到高效降酚菌的標準。
圖7苯酚降解曲線
3結論
3.1從綿陽某絕緣材料廠的活性污泥中分離得到4株苯酚降解菌。其中菌株Y_1的降酚能力最強，經(jīng)分子生物學方法鑒定，初步確定該菌為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)。
3.2生理生化特性表明，當溫度在15～40℃、pH值在4.4～10.0以及NaCl濃度在2%～10%時該菌均能良好生長。
3.3降酚特性研究表明，當苯酚初始濃度為1 100 mg/L時，在36 h內(nèi)，菌株Y_1對苯酚的降解率達到了90%，屬于高效降酚菌。
本文分離篩選出一株能高效降解苯酚的菌株Y_1，能在以苯酚為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中生長，其生長與降酚同步進行。該菌屬主要在害蟲防治中發(fā)揮作用，用于降解苯酚的蘇云金芽孢桿菌鮮見報道。菌株Y_1降解苯酚的能力較強，且能很好地適應環(huán)境，是一株理想的苯酚降解出發(fā)菌株，具有重要的研究價值。
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