2結(jié)果
2.1活菌計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
2.1.1假交替單胞菌WCPW15003活菌計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線
不同稀釋倍數(shù)菌懸液的吸光值與其對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)的線性方程為：y=1.8976x+0.137，r2=0.9877[x為假交替單胞菌WCPW15003稀釋倍數(shù)倒數(shù)的值，y為假交替單胞菌WCPW15003稀釋后吸光值(OD600)]；標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=134.36x-17.976，r2=0.9924[x為假交替單胞菌WCPW15003吸光值(OD600)，y為假交替單胞菌WCPW15003活菌菌落數(shù)]，菌液吸光值與活菌數(shù)之間有顯著線性關(guān)系(圖1)。因此，假交替單胞菌WCPW15003的菌懸液吸光值與其活菌數(shù)量間存在良好線性關(guān)系，可用于后續(xù)菌液密度的測定。
圖1假交替單胞菌WCPW15003活菌計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線
2.1.2哈維氏弧菌PBVH3311活菌計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線
不同稀釋倍數(shù)菌懸液的吸光值與其對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)的線性方程為：y=1.42x+0.2052，r2=0.981[x為哈維氏弧菌PBVH3311稀釋倍數(shù)倒數(shù)的值，y為哈維氏弧菌PBVH3311稀釋后吸光值(OD600)]；標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=5.1028x-1.2664，r2=0.9956[x為哈維氏弧菌PBVH3311吸光值(OD600)，y為哈維氏弧菌PBVH3311活菌菌落數(shù)]，菌液吸光值與活菌數(shù)之間有顯著線性關(guān)系(圖2)。因此，哈維氏弧菌PBVH3311菌懸液吸光值與其活菌數(shù)量間線性關(guān)系良好，可用于后續(xù)菌液密度的測定。
圖2哈維氏弧菌PBVH3311活菌計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線
2.2菌株生長曲線
2.2.1假交替單胞菌WCPW15003生長曲線
假交替單胞菌WCPW15003的生長曲線符合典型“S”型細(xì)菌生長曲線。即假交替單胞菌WCPW15003的生長周期可分為停滯期、增長期、平臺(tái)期和衰亡期共4個(gè)時(shí)期。其中，接種后0～0.5 h為該菌株的停滯期，0.5～1.5 h為緩慢增長期，1.5～2.5 h進(jìn)入短暫平臺(tái)期，2.5～10 h進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期，10～36 h進(jìn)入平臺(tái)期，36 h后進(jìn)入衰亡期(圖3)。
圖3假交替單胞菌WCPW15003生長曲線
2.2.2哈維氏弧菌PBVH3311菌株生長曲線
哈維氏弧菌PBVH3311的生長曲線符合典型“S”型細(xì)菌生長曲線。即哈維氏弧菌PBVH3311的生長生長周期可分為停滯期、增長期、平臺(tái)期和衰亡期共4個(gè)時(shí)期。接種后0～0.5 h進(jìn)入停滯期，0.5～1.5 h進(jìn)入增長期，1.5～4.5 h進(jìn)入短暫平臺(tái)期，4.5～20 h進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期，20～44 h進(jìn)入緩慢增長期，44～68 h進(jìn)入平臺(tái)期，68 h后進(jìn)入衰亡期(圖4)。
2.3培養(yǎng)基優(yōu)化
培養(yǎng)24 h后，不同假交替單胞菌WCPW15003培養(yǎng)基中菌懸液的密度為2.31×108～3.36×109cfu/mL(圖5)。其中2216E培養(yǎng)基的活菌數(shù)最低，為2.31×108cfu/mL；試驗(yàn)組A的活菌數(shù)最高，為3.36×109cfu/mL；試驗(yàn)組B的活菌數(shù)為1.33×109cfu/
圖4哈維氏弧菌PBVH3311生長曲線
mL；試驗(yàn)組C的活菌數(shù)為1.95×109cfu/mL。與對(duì)照組相比，3個(gè)試驗(yàn)組的菌懸液密度均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；盡管試驗(yàn)組B和試驗(yàn)組C間僅達(dá)到顯著性差異(P<0.05)，但試驗(yàn)組A與試驗(yàn)組B或試驗(yàn)組C間均達(dá)到了極顯著差異(P<0.01)。
圖5培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果
2.4拮抗試驗(yàn)
當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311密度為101～102cfu/mL時(shí)，所有組別未出現(xiàn)明顯的拮抗效果。當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311密度為103cfu/mL時(shí)，假交替單胞菌WCPW15003的最小抑菌密度為103cfu/mL，抑菌圈直徑為(8.40±0.16)mm；當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311密度為104、105cfu/mL時(shí)，假交替單胞菌WCPW15003的最小抑菌密度均為105cfu/mL，抑菌圈直徑分別為(9.64±0.07)、(8.24±0.22)mm。拮抗作用效果為全透明抑菌圈(圖6)。
當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311密度為106cfu/mL時(shí)，假交替單胞菌WCPW15003的最小抑菌密度為107cfu/mL，抑菌圈直徑為(18.15±0.09)mm；當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311密度為107、108cfu/mL時(shí)，假交替單胞菌WCPW15003的最小抑菌密度均為108cfu/mL，抑菌圈直徑分別為(18.53±1.34)、(11.68±2.58)mm。拮抗作用效果為全透明抑菌圈，外側(cè)還有一圈半透明抑菌圈(圖6)。
總之，只有當(dāng)哈維氏弧菌PBVH3311≥103cfu/mL時(shí)，假交替單胞菌WCPW15003才會(huì)產(chǎn)生拮抗作用，且假交替單胞菌WCPW15003的密度應(yīng)相當(dāng)于或高于哈維氏弧菌PBVH3311的密度，拮抗作用大小與假交替單胞菌WCPW15003密度呈正相關(guān)性。
表3不同密度假交替單胞菌與哈維氏弧菌拮抗抑菌圈直徑(打孔器直徑5.98 mm)mm
注：表中數(shù)據(jù)為剔除掉打孔器外徑5.98 mm的結(jié)果，“0”表示不產(chǎn)生拮抗效果.
圖6假交替單胞菌WCPW15003與哈維氏弧菌PBVH3311拮抗作用效果a.假交替單胞菌；b.哈維氏弧菌；c.全透明抑菌圈；d.半透明抑菌圈.
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