目前，魚類細(xì)胞作為研究工具頗受關(guān)注，已經(jīng)被應(yīng)用到魚類腫瘤學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)、遺傳學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、生理學(xué)和資源保護(hù)等方面。與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相比較，魚類細(xì)胞培養(yǎng)具有一定優(yōu)勢：細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化程度高、均一性好；魚類離體培養(yǎng)細(xì)胞尤其是原代培養(yǎng)細(xì)胞，其生理生化功能接近在體狀態(tài)，能夠快速獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果；而且可根據(jù)魚類生長階段，進(jìn)行不同時(shí)期影響研究；可重復(fù)性高，離體條件下可以更為精確控制實(shí)驗(yàn)條件，有針對性地開展研究。因此，本研究成功進(jìn)行了草魚腦細(xì)胞的原代培養(yǎng)，為進(jìn)一步開展體外生理調(diào)控機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
草魚購于湖北仙桃排湖漁場，暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水系統(tǒng)，選取健康且體表無損傷的個(gè)體，平均體重(187.50±8.42)g。
實(shí)驗(yàn)試劑
L-15液體培養(yǎng)基、胰蛋白酶均為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)為Hyclone公司產(chǎn)品；CellTiter 96®AQueous One Solution Cell Proliferation Assay為Promega公司產(chǎn)品。青霉素、鏈霉素、兩性霉素分別配制成母液，經(jīng)0.22μm濾過除菌，分裝，-20℃保存。PBS緩沖液：0.01M Na2HPO4、0.01M NaH2PO4、0.15M NaCl，pH 7.2，高壓滅菌，4℃保存。4.0%臺盼藍(lán)母液，用濾紙過濾，4℃保存，使用時(shí)用PBS將其濃度稀釋至0.4%。
細(xì)胞原代培養(yǎng)
實(shí)驗(yàn)草魚冰上麻醉，剪斷鰓部脈弓，放血約10 min，70%乙醇體表消毒。在無菌條件下，解剖取腦，以含有抗生素500 IU/mL青霉素和500μg/mL鏈霉素及2.5μg/mL兩性霉素的PBS緩沖液沖洗3次。分別采用不同方法嘗試進(jìn)行原代培養(yǎng)：1)組織塊培養(yǎng)法，用眼科剪將組織剪碎成約1～2 mm3的小塊。用完全培養(yǎng)基(10%FBS，青霉素100 U/mL、鏈霉素100μg/mL、兩性霉素2.5μg/mL)浸潤培養(yǎng)瓶，將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，均勻排列，加入1 mL完全培養(yǎng)基，于28℃CO2培養(yǎng)箱(SANYO，MCO-18AIC)中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的1～2 d內(nèi)避免移動(dòng)培養(yǎng)瓶，以便組織塊貼壁，在2～3 d吸出培養(yǎng)基，添加3 mL新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。2)消化法，用眼科剪將組織切成2～3 mm3小塊，以便于消化。0.25%胰蛋白酶酶解處理，期間輕輕搖動(dòng)數(shù)次。消化液混濁則吸出少許消化液于顯微鏡鏡檢，若組織已分散成單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)即終止消化。通過30μm不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。600 rpm低速離心10 min收集細(xì)胞，完全培養(yǎng)基再懸浮，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3)機(jī)械破碎法，在完全培養(yǎng)基浸潤的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將腦組織置于200目滅菌尼龍網(wǎng)上，采用無菌注射器的橡膠推頭輕輕擠壓使腦組織通過網(wǎng)孔，得到細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞懸液后通過100目的尼龍網(wǎng)過濾，600 rpm低速離心10 min洗滌細(xì)胞一次，棄掉上清液后加入完全培養(yǎng)基重懸浮后，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
細(xì)胞活力測定
細(xì)胞活力測定采用CellTiter 96®AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒測定。采用如1.3中機(jī)械破碎法制備細(xì)胞懸液，取出20μL細(xì)胞懸液，加入等體積的0.4%臺盼藍(lán)染液，利用血球計(jì)數(shù)板快速估算細(xì)胞密度以及檢驗(yàn)細(xì)胞成活率[細(xì)胞成活率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100]，當(dāng)細(xì)胞活力大于90%時(shí)可用。用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至2×106個(gè)/mL，細(xì)胞懸液分別接種到24孔及96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁穩(wěn)定，在培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后，分別計(jì)數(shù)其細(xì)胞數(shù)及測定其細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，向培養(yǎng)板每孔中加入20μL CellTiter 96®AQueous One Solution Reagent溶液，黑暗中孵育4 h后終止培養(yǎng)，490 nm波長讀取吸光度值。
結(jié)果顯示，原代腦細(xì)胞的活力可以穩(wěn)定地保持3 d，超過3 d后，細(xì)胞明顯退化。因此在當(dāng)前培養(yǎng)條件下所制備的原代魚腦細(xì)胞可用于部分生理機(jī)制的離體分析。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對魚類腦細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行了大量研究。利用魚類原代腦細(xì)胞進(jìn)行離體測試已得到應(yīng)用，主要包括魚類病毒感染與細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，以及持久性有機(jī)污染物的毒理學(xué)相關(guān)研究；但是持久細(xì)胞系隨著代數(shù)的增加，其細(xì)胞的基因型和表型都有可能發(fā)生改變，導(dǎo)致某些重要的生理功能和分化特征喪失，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性較差；而魚類細(xì)胞的原代培養(yǎng)是從活體動(dòng)物獲取組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)，細(xì)胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出原有組織的特性，在一定程度上更能反映體內(nèi)狀態(tài)，測試的結(jié)果比較準(zhǔn)確，重復(fù)性好。
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