3討論
3.1嗜堿鹽單胞菌的生長(zhǎng)特性與應(yīng)用潛力
嗜堿鹽單胞菌(H.alkaliphila)適宜棲息于高鹽堿生境(pH 7.5?13.0，10%?20%NaCl)，可利用葡萄糖、甘露醇和蔗糖等碳源的嗜堿、耐鹽革蘭陰性細(xì)菌[21]，廣泛分布于鹽堿湖和海洋生境。嗜堿鹽單胞菌被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)次級(jí)代謝物和進(jìn)化污染水源，具有良好的應(yīng)用研究前景[21]。如Romano等[21]從意大利鹽堿湖Campania Region中分離一株嗜堿耐鹽菌株H.alkaliphila 18bAG，該菌株可合成PHB和胞外多聚物(extracellular polymeric substances,EPS)；Berlanga等[22]從鹽堿湖Ebro Delta中分離到一株H.alkaliphila MAT16，該菌株可以合成聚羥基脂肪酸酯(poly-hydroxyalkanoates,PHA)；Ren等[23]從海水中分離獲得一株嗜堿耐鹽菌株H.alkaliphila HRL-9，該菌株具有脫氮反硝化能力。本研究共計(jì)分離10株5種鹽單胞菌，如H.alkaliphila、H.venusta、H.chromatireducens、H.hydrothermalis和H.campaniensis，其中H.alkaliphila占比最高(4株，豐度占比40%)。分離獲得的H.alkaliphila菌株大多數(shù)具有較強(qiáng)的耐鹽堿特性，耐受鹽度0.0?3.0 mol/L，pH 8.0?13.0，這可能由于扎布耶湖湖水碳酸鹽濃度飽和且pH高所致。此外，相較于其他菌株，H.alkaliphila ZB109胞內(nèi)ectoine積聚量較高(優(yōu)化前303.62 mg/L)，發(fā)酵條件優(yōu)化后可達(dá)696.313 mg/L，可能成為ectoine生物合成的資源菌種，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
3.2影響鹽單胞菌胞內(nèi)ectoine積聚量的因素分析
鹽單胞菌通過(guò)胞內(nèi)積累具有高度水溶性的有機(jī)化合物(ectoine或羥基四氫嘧啶)以應(yīng)對(duì)極端鹽堿環(huán)境脅迫，表現(xiàn)為菌株生長(zhǎng)量(OD600)和ectoine積聚量先增加后降低[24-25]。如周月慧等[26]對(duì)菌株H.venusta SL21研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度為2.0 mol/L時(shí)，ectoine合成量最高為272.8 mg/L，當(dāng)NaCl濃度超過(guò)2.5 mol/L時(shí)，ectoine合成量減少；王慧敏等[27]對(duì)菌株Halomonas sp.Y研究發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度增加，菌株胞內(nèi)合成ectoine的積聚量先增后減，最佳NaCl濃度為150 g/L，ectoine合成量可達(dá)246.6 mg/L；王魁榮等[28]對(duì)菌株Halomonas sp.NY-011研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到120 g/L時(shí)，菌株胞內(nèi)ectoine的積聚量可達(dá)71.5 mg/g，當(dāng)NaCl濃度大于150 g/L時(shí)，菌株NY-011基本停止生長(zhǎng)。這些報(bào)道與本研究的結(jié)果相似，即菌株ZB109的生長(zhǎng)量與胞內(nèi)ectoine積聚量隨著鹽度的增加，呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)。這可能由于鹽脅迫促進(jìn)菌株ZB109胞內(nèi)ectoine合成相關(guān)基因表達(dá)量增加，而鹽濃度較高時(shí)，菌株ZB109菌體生長(zhǎng)受抑制。此外，Plackett-Burman和Box-Behnken試驗(yàn)顯示，NaCl濃度是影響菌株ZB109胞內(nèi)ectoine積聚量的最主要因素(P值分別為0.000 2和0.003 5)。
為提高菌株胞內(nèi)ectoine的積聚量，通常在鹽單胞菌發(fā)酵過(guò)程中添加天冬氨酸和谷氨酸等中間代謝物或前體底物。如沈國(guó)平等[29]對(duì)菌株H.campaniensis XH26研究發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)基中MSG濃度增加，菌株胞內(nèi)合成ectoine的積聚量先增后減，當(dāng)MSG濃度為30 mmol/L時(shí)，ectoine的積聚量達(dá)到最大值321.83 mg/L；劉靜[30]對(duì)菌株Halomonas sp.X26研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中MSG為0.035 mol/L時(shí)，胞內(nèi)ectoine積聚量為491.19 mg/L。本研究Plackett-Burman和Box-Behnken試驗(yàn)顯示，MSG是影響菌株ZB109胞內(nèi)ectoine積聚量的次要因素(P值分別為0.022 0和0.025 4)。通過(guò)單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著MSG濃度的增加，菌株ZB109的生長(zhǎng)量(OD600)與胞內(nèi)ectoine積聚量呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，這可能由于MSG濃度升高的同時(shí)，增加了培養(yǎng)基中Na+濃度，從而抑制菌株ZB109的生長(zhǎng)。此外，文獻(xiàn)綜合顯示pH值也是影響鹽單胞菌胞內(nèi)ectoine的積聚量的因素之一。如朱德銳等[9]對(duì)菌株H.ventosae QHL5研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH 8.0時(shí)，菌株ectoine干重比最大，當(dāng)pH>9.5后，菌株生長(zhǎng)量明顯下降。本研究中菌株ZB109在pH 10.0時(shí)生長(zhǎng)量最大，但是單因素試驗(yàn)顯示，pH對(duì)菌株ZB109胞內(nèi)ectoine積聚量影響的規(guī)律性不顯著，這可能由于ectoine發(fā)酵培養(yǎng)基中存在大量Mg2+和Ca2+，高pH條件下，Mg2+和Ca2+被消耗所致。后續(xù)研究將基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)深入探究NaCl、MSG濃度和pH影響菌株ZB109的胞內(nèi)ectoine積聚量的機(jī)制，為進(jìn)一步提高鹽單胞菌ectoine積聚量提供一定的理論依據(jù)。
3.3響應(yīng)面法提高菌株胞內(nèi)ectoine積聚量的應(yīng)用前景
響應(yīng)面法基于綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模，是目前優(yōu)化培養(yǎng)基的主流實(shí)驗(yàn)方法之一[31]。文獻(xiàn)綜合顯示，響應(yīng)面法廣泛應(yīng)用于提高菌株胞內(nèi)ectoine積聚量，是分析影響ectoine積聚量關(guān)鍵因素的重要手段。如Kushwaha等[32]通過(guò)Box-Behnken和響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基成分，當(dāng)培養(yǎng)基鹽度達(dá)到15%時(shí)，菌株Halomonas sp.SBS10胞內(nèi)ectoine積聚量可達(dá)617 g/g；Omara等[33]通過(guò)Plackett-Burman和Box-Behnken優(yōu)化培養(yǎng)基成分，結(jié)果表明在最適組合下(培養(yǎng)時(shí)間78 h、pH 7.5和鹽度8%)，Vibrio sp.CS1和Salinivibrio costicola SH3胞內(nèi)ectoine積聚量分別可達(dá)477 mg/L和215 mg/L；汪明香等[15]通過(guò)Plackett-Burman和Box-Behnken優(yōu)化培養(yǎng)基成分，結(jié)果表明在最適組合下(0.05 g/L磁性納米金屬顆粒Fe3O4NPs、1.53 mol/L NaCl和0.03 mol/L MSG)，H.campaniensis XH26胞內(nèi)ectoine積聚量可達(dá)640.28 mg/L。本研究以NaCl濃度、Mg2+濃度、Ca2+濃度、MSG濃度和CaCO3濃度為單因素，菌株ZB109胞內(nèi)ectoine積聚量為響應(yīng)值，通過(guò)Plackett-Burman篩選出關(guān)鍵因素是NaCl濃度、Mg2+濃度和MSG濃度，并通過(guò)Box-Behnken明確最優(yōu)培養(yǎng)基組分(NaCl 1.25 mol/L；Mg2+0.09 mol/L，MSG 0.08 mol/L)。使用優(yōu)化培養(yǎng)基37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，菌株ZB109胞內(nèi)ectoine積聚量可達(dá)696.313 mg/L，較優(yōu)化前(303.62 mg/L)提高了392.693 mg/L(129.34%)。綜上，在提高菌株胞內(nèi)四氫嘧啶積聚量方面，響應(yīng)面法具有良好的方法學(xué)應(yīng)用前景，后續(xù)研究將甄選不同類型的碳氮源分析菌株ZB109胞內(nèi)ectoine積聚量的變化，為進(jìn)一步優(yōu)化菌株ZB109發(fā)酵培養(yǎng)基提供一定的參考依據(jù)。
4結(jié)論
利用Horikoshi-Ⅰ培養(yǎng)基分離獲得鹽單胞菌合計(jì)10株，分屬6個(gè)種，優(yōu)勢(shì)種是嗜堿鹽單胞菌(4株，豐度占比40%)，分離菌株均屬于極端嗜堿鹽菌。生理生化試驗(yàn)顯示，菌株ZB109可利用的碳氮源寬泛(如KNO3、葡萄糖和蔗糖等)，鹽堿耐受范圍較大(最佳生長(zhǎng)鹽度范圍0.5?2.5 mol/L，最佳生長(zhǎng)pH 8.0?10.0)，胞內(nèi)ectoine積聚量較高(優(yōu)化前303.62 mg/L)，具有生產(chǎn)四氫嘧啶類化合物的潛力。通過(guò)Plackett-Burman、Box-Behnken試驗(yàn)和響應(yīng)面法，明確NaCl、Mg2+和MSG是影響菌株ZB109胞內(nèi)ectoine積聚量的關(guān)鍵因素。在此基礎(chǔ)上對(duì)ectoine發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后培養(yǎng)基的NaCl和MSG的濃度分別提高至72.5和15.4 g/L，MgSO4·7H2O濃度降低至22.2 g/L，胞內(nèi)ectoine積聚量可達(dá)696.313 mg/L，提高了392.693 mg/L，為ectoine的生物合成積累了潛在菌種資源。
嗜堿鹽單胞菌菌株生理生化與生長(zhǎng)特性、最優(yōu)發(fā)酵條件——摘要、材料與方法
嗜堿鹽單胞菌菌株生理生化與生長(zhǎng)特性、最優(yōu)發(fā)酵條件——結(jié)果與分析
嗜堿鹽單胞菌菌株生理生化與生長(zhǎng)特性、最優(yōu)發(fā)酵條件——討論、結(jié)論
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