2結果與分析
2.1分離菌株的生長特性和形態(tài)學特征
從扎布耶鹽堿湖水樣中分離獲得鹽單胞菌10株(表2)，其菌落形態(tài)多呈圓形、淡黃色，部分菌株呈白色。參照文獻[14]確定分離菌株均屬于極端嗜堿鹽菌(1.53 mol/L<鹽度<5.53 mol/L，pH>10.0)。16S rRNA基因序列分析顯示：鹽單胞菌分屬5個種，其中嗜堿鹽單胞菌(H.alkaliphila)4株，占40%，樊氏鹽單胞菌(H.venusta)3株，占30%，鉻還原鹽單胞菌(H.chromatireducens)1株，占10%，熱液鹽單胞菌(H.hydrothermalis)1株，占10%，坎帕尼亞鹽單胞菌(H.campaniensis)1株，占10%。初步檢測10株鹽單胞菌的胞內ectoine，顯示積聚量為0.00?303.62 mg/L。分離株嗜堿鹽單胞菌H.alkaliphila ZB109的耐鹽堿能力良好，生長鹽度0.0?3.0 mol/L，pH 8.0?11.0，ectoine積聚量較高(303.62 mg/L)。菌株ZB109的菌落形態(tài)(圖1A)呈圓形，淡黃色，不透明，中心隆起，邊緣光滑；革蘭氏染色陰性，顯微形態(tài)呈長桿狀，單個或成串排列(圖1B)，掃描電子顯微鏡形態(tài)(圖1C)呈長圓柱狀，長度約10μm，菌體輪廓清晰圓潤，部分發(fā)生粘連，表面絨毛感顆粒狀聚合物，周身具有少量細短纖毛。
表2分離菌株耐鹽耐堿范圍和ectoine積聚量
圖1菌株ZB109的菌落形態(tài)(A)、菌體形態(tài)(B)和細胞形態(tài)(C)
2.2菌株ZB109的生理生化鑒定結果及系統(tǒng)發(fā)育樹
參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]和《伯杰細菌鑒定手冊》[18]進行菌株ZB109的碳氮源利用與生理生化鑒定。結果顯示：該菌株能利用精氨酸、賴氨酸、(NH4)2SO4、NH4Cl、KNO3、葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁甙、阿拉伯糖、檸檬酸、淀粉和麥芽糖作為唯一碳氮源生長，不能利用鳥氨酸和乳糖，β-半乳糖苷酶(ONPG)和脲酶試驗為陽性，V-P試驗、產H2S試驗、吲哚試驗和明膠液化試驗均呈陰性，與鹽單胞菌菌株H.ventosae QHL5[16]、Halomonas sp.QHL25[19]和Halomonas sp.A20[20]的相關結果一致。16S rRNA基因序列比對分析顯示，菌株ZB109與H.alkaliphila(KR140235.1)的相似性最高(99.78%)。使用MEGA v.11.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，初步確定菌株ZB109(OR651760.1)與鹽單胞菌屬菌株進化同源，分類隸屬于變形菌門(Proteobacteria)γ-變形桿菌綱(Gammaproteobacteria)海洋螺菌目(Oceanospirillales)鹽單胞菌科(Holomonadaceae)鹽單胞菌屬(Halomonas)嗜堿鹽單胞菌(H.alkaliphila)。
圖2菌株ZB109及其近源屬種的系統(tǒng)發(fā)育分析
分支數字是自展值；距離標尺數字是相對進化長度；括號中數字是菌株的GenBank登錄號
2.3菌株ZB109胞內ectoine積聚量的單因素試驗
設置單因素濃度分組(NaCl、Mg2+、Ca2+、MSG、CaCO3及pH)，利用ectoine發(fā)酵培養(yǎng)基37℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，檢測菌株ZB109的生物量和胞內ectoine的積聚量(圖3)。綜合分析顯示：菌株ZB109積聚ectoine的最適NaCl濃度是1.5 mol/L，積聚量為558 mg/L(圖3A)；最適Mg2+濃度是0.1 mol/L，積聚量為570 mg/L(圖3B)；最適Ca2+濃度是4.0μmol/L，積聚量為576 mg/L(圖3C)；最適MSG濃度是0.08 mol/L，積聚量為529 mg/L(圖3D)；最適CaCO3濃度是20 g/L，積聚量為551 mg/L(圖3E)；最適pH值10.0，積聚量為236 mg/L(圖3F)。甄選NaCl、Mg2+、Ca2+、MSG、CaCO3的最適濃度，進行Plackett-Burman關鍵單因素的變量試驗。
圖3不同單因素條件下菌株ZB109的生長量(OD600)和ectoine積聚量
A：NaCl濃度；B：Mg2+濃度；C：Ca2+濃度；D：MSG濃度；E：CaCO3濃度；F：pH
2.4 Ectoine發(fā)酵條件優(yōu)化結果
基于Plackett-Burman試驗篩選影響菌株ZB109胞內ectoine積聚量的顯著因素(表3)。結果顯示：模型方差F值為10.31，P<0.05，表明模型具有統(tǒng)計學意義。3個關鍵因子的變化顯著影響菌株ZB109的胞內ectoine積聚量(P<0.05)，影響強度依次為NaCl(X1)>Mg2+(X2)>MSG濃度(X4)，而Ca2+(X3)與CaCO3濃度(X5)的變化無顯著影響(P>0.05)。使用Design-Expert v.11.0軟件擬合實驗模型，建立線性回歸方程：Y=232.10?143.31X1?71.08X2?0.619 4X3+66.59X4?34.09X5，式中Y為ectoine積聚量，因素X1?X5分別為NaCl、Mg2+、Ca2+、MSG和CaCO3濃度?；貧w決定系數R2=0.837 5，模型擬合程度較好；修正決定系數R(Adj)2=0.756 3，表明75.63%的響應值變化可以通過擬合模型進行解釋。
表3 Plackett-Burman法方差分析結果
優(yōu)選NaCl、Mg2+和MSG濃度進行Box-Behnken試驗設計，使用軟件Design-Expert v.11.0進行多元線性回歸擬合分析(表4)。以ectoine積聚量(Y)為響應值，建立NaCl(A)、Mg2+(B)和MSG濃度(C)的響應面模型：Y=680.02?23.84A?17.25B?15.52C?1.91AB?19.13AC+4.16BC?40.88A2?32.34B2?69.38C2。方差分析顯示(表5)：該模型顯著(P<0.05)，失擬項不顯著(P>0.05)，R2=0.974 5，F=29.77，模型擬合程度較好，修正決定系數R(Adj)2=0.941 8，表明94.18%的響應值變化可以通過擬合模型進行解釋，并分析和預測ectoine的積聚量。由各因素P值可知，NaCl濃度(A)、Mg2+濃度(B)和MSG濃度(C)為顯著影響因素，其中NaCl濃度影響程度最大，其次是Mg2+濃度和MSG濃度。此外，A和C之間的交互作用顯著；A和B、B和C之間的交互作用最不顯著；A2、B2和C2曲面效應均顯著。
表4 Box-Behnken試驗設計及響應值
、
表5響應面模型的方差分析
2.5多因素交互分析結果
使用Design-Expert v.11.0繪制3D Surface響應面模型圖，分析不同因素的交互作用影響ectoine積聚量(圖4)。綜合分析顯示，不同兩因素交互作用條件下，ectoine的積聚量均呈先升高后降低的變化趨勢，峰值不同。NaCl和Mg2+交互作用分析表明(圖4A)：當0.08 mol/L MSG濃度時，最高峰值條件為1.0 mol/L NaCl和0.1 mol/L Mg2+。NaCl和MSG交互作用分析表明(圖4B)：當0.1 mol/L Mg2+濃度時，最高峰值條件為0.08 mol/L MSG和1.0 mol/L NaCl。Mg2+和MSG交互作用分析表明(圖4C)：當1.0 mol/L NaCl濃度時，最高峰值條件為0.1 mol/L Mg2+和0.08 mol/L MSG。使用最優(yōu)發(fā)酵條件組合(NaCl 1.25 mol/L，Mg2+0.09 mol/L，MSG 0.08 mol/L)進行3次重復實驗，檢測ectoine積聚量(均值696.313 mg/L)，與預測值(701.436 mg/L)非常接近，相對誤差小于5%，說明該驗證模型有效可行。
圖4 NaCl濃度、Mg2+濃度和MSG濃度交互作用
A：NaCl和Mg2+交互作用分析；B：NaCl和MSG交互作用分析；C：Mg2+和MSG交互作用分析
2.6培養(yǎng)基優(yōu)化前后的發(fā)酵效果比較
優(yōu)化ectoine發(fā)酵培養(yǎng)基與初始培養(yǎng)基相比，NaCl和MSG的濃度分別提高為72.5 g/L和15.4 g/L，Mg2+濃度降低為22.2 g/L；優(yōu)化后菌株ZB109胞內ectoine的積聚量提高了392.693 mg/L(129.34%)，差異極顯著(P<0.01)。由此表明，優(yōu)化培養(yǎng)條件致使菌株ZB109 ectoine的積聚量顯著提高。
嗜堿鹽單胞菌菌株生理生化與生長特性、最優(yōu)發(fā)酵條件——摘要、材料與方法
嗜堿鹽單胞菌菌株生理生化與生長特性、最優(yōu)發(fā)酵條件——結果與分析
嗜堿鹽單胞菌菌株生理生化與生長特性、最優(yōu)發(fā)酵條件——討論、結論
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