摘要:【背景】西藏扎布耶鹽堿湖水體富含高濃度CO32?、HCO3?和Na+，可能棲息具有潛在應(yīng)用價值的鹽單胞菌(Halomonas sp.)菌株。【目的】篩選積聚相容溶質(zhì)四氫嘧啶的鹽單胞菌菌株，并分析四氫嘧啶積聚的影響因素和最優(yōu)發(fā)酵條件。【方法】采用Horikoshi-Ⅰ培養(yǎng)基分離扎布耶鹽堿湖水樣中嗜堿鹽且能高效積聚四氫嘧啶的鹽單胞菌株，并明確生理生化特性和分類學(xué)地位?；趩我蛩貤l件、Plackett-Burman、Box-Behnken試驗和HPLC檢測，分析菌株胞內(nèi)四氫嘧啶積聚量的關(guān)鍵影響因素并優(yōu)化其發(fā)酵條件?！窘Y(jié)果】篩選獲得扎布耶鹽堿湖鹽單胞菌共計10株(分屬5個種)，優(yōu)勢種是嗜堿鹽單胞菌(H.alkaliphila，4株，占40%)。H.alkaliphila ZB109的最佳生長鹽度范圍為0.5?2.5 mol/L，最適生長pH值8.0?10.0，四氫嘧啶的初始積聚量為303.62 mg/L。菌株ZB109的菌落圓形，邊緣光滑，呈黃色，革蘭氏染色陰性，顯微形態(tài)呈短桿狀、周身纖毛。NaCl、Mg2+和底物L(fēng)-谷氨酸鈉濃度是菌株ZB109積聚四氫嘧啶的關(guān)鍵影響因素。采用響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件，菌株ZB109單批次搖瓶發(fā)酵48 h的四氫嘧啶積聚量可達(dá)696.313 mg/L。【結(jié)論】菌株ZB109兼具耐鹽和耐堿的生長特性，相較于其他分離鹽單胞菌分離株，四氫嘧啶的積聚潛力更大，可為后續(xù)四氫嘧啶的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)提供良好的菌種種質(zhì)資源。
鹽單胞菌屬(Halomonas)分類隸屬于γ-變形桿菌綱(Gammaproteobacteria)海洋螺菌目(Oceanospirillales)鹽單胞菌科(Halomonadaceae)，是一類耐鹽、好氧的革蘭氏陰性細(xì)菌，大多數(shù)呈桿狀，耐鹽生長范圍較為寬泛。截至2023年12月，模式微生物基因組數(shù)據(jù)庫(List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature,LPSN,https://lpsn.dsmz.de/genus/halomonas)共計收錄鹽單胞菌屬菌株172個種，典型代表如延長鹽單胞菌(H.elongata)、樊氏鹽單胞菌(H.ventosae)、藍(lán)晶鹽單胞菌(H.bluephagnesis)和坎帕尼亞鹽單胞菌(H.campaniensis)等。鹽單胞菌是發(fā)酵生產(chǎn)生物塑料聚β-羥基丁酸(poly-β-hydroxybutyric acid,PHB)和相容溶質(zhì)(四氫嘧啶或羥基四氫嘧啶)的典型模式菌株。鹽單胞菌廣泛分布于海洋、鹽湖、鹽堿湖、鹽堿地沙漠等特殊生境。Zhang等曾從小柴旦鹽湖分離獲得鹽單胞菌(Halomonas sp.)XH26，四氫嘧啶(ectoine)的積聚量達(dá)到456.82 mg/L；朱德銳等從青海湖分離獲得樊氏鹽單胞菌(H.ventosae)QHL5，ectoine積聚量為379.6 mg/L；Quillaguamán等從鹽堿湖Laguna Colorada中分離獲得玻利維亞鹽單胞菌(H.boliviensis)LC1，ectoine積聚量可達(dá)740 mg/L。
鹽堿湖為一類具有高礦化度和高堿性水化學(xué)特征的湖泊，生境中常棲息耐鹽、耐堿或兼性耐鹽堿的野生型鹽單胞菌株，是鹽單胞菌的主要分離來源地。Zhang等從烏魯木齊鹽堿湖(礦化度89.32 g/L，pH 8.3)分離獲得一株耐鹽堿的鹽單胞菌新種H.urumqiensis BZ-SZ-XJ27；Romano等從鹽堿湖Campania Region(礦化度58.5 g/L，pH 8.5)分離獲得一株耐鹽堿的鹽單胞菌新種H.campaniensis 5AG；Poli等從南極鹽堿湖Cape Russell(礦化度156.8 g/L，pH 9.0)分離獲得一株嗜鹽、嗜冷和耐堿的鹽單胞菌新種H.alkaliantarctica CRSS。扎布耶鹽堿湖(E83°57′?84°15′，N31°27′?31°34′)位于西藏日喀則地區(qū)，礦化度243?396 g/L，pH 9.0?9.5，水體富集扎布耶石、鉀芒硝、氯碳鈉鎂石和天然堿等，屬于典型的碳酸鹽型鹽湖。陶宇杰等利用Illumina高通量測序分析扎布耶鹽堿湖(南湖)的細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)鹽單胞菌具有較高的物種豐度(0.54%?8.75%)。若采用純培養(yǎng)分離可能獲得具有潛在應(yīng)用價值的鹽單胞菌?；诖?，本研究以扎布耶鹽堿湖水樣為研究對象，分離篩選鹽單胞菌菌種資源，分析菌株生理生化與生長特性、胞內(nèi)ectoine積聚量；基于單因素試驗與響應(yīng)面法優(yōu)化ectoine的發(fā)酵條件，提高ectoine的積聚量，為后續(xù)菌株的基因改造和代謝工程菌株研究提供良好的菌種資源。
1、材料與方法
1.1樣品
2019年7月中旬采集扎布耶鹽堿湖的水泥混合物樣本，樣本置于4℃車載冰箱載回。
1.2主要試劑和儀器
NaCl和L-谷氨酸鈉(L-monosodium glutamate monohydrate,MSG)等分析純；細(xì)菌全基因提取試劑盒；細(xì)菌生化鑒定試劑盒；2×PCR Mix；Taq DNA聚合酶；Ectoine標(biāo)準(zhǔn)品。PCR儀；HPLC；掃描電子顯微鏡；光學(xué)顯微鏡。
1.3培養(yǎng)基及純培養(yǎng)菌株的分離
Horikoshi-Ⅰ分離培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10.0，蛋白胨5.0，酵母粉5.0，K2HPO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.2。Ectoine發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：KCl 55.9，MgSO4·7H2O 24.7，MSG 6.5，檸檬酸鈉3.0，酶水解酪素7.5，無水CaCl2 0.2，酵母浸出物2.0，115℃滅菌15 min。使用NaCl溶液(6 mol/L)配制鹽梯度，用Na2CO3溶液(1 mol/L)調(diào)節(jié)pH值，固體培養(yǎng)基添加16 g/L瓊脂粉。扎布耶鹽堿湖水樣(50μL)直接涂布Horikoshi-Ⅰ固體培養(yǎng)基(鹽梯度組：0.0?3.0 mol/L，間隔0.5；pH梯度組：8.0?13.0，間隔1.0)，10?15平板/梯度組，37℃恒溫箱培養(yǎng)72 h。挑取不同形態(tài)的菌落進(jìn)行活化(Horikoshi-Ⅰ培養(yǎng)基、37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h)，劃線純化菌株3?4次。
1.4菌株生長特性與胞內(nèi)ectoine積聚量分析
將1.3分離獲得的待測菌株接種于Horikoshi-Ⅰ培養(yǎng)基37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化。設(shè)置不同NaCl濃度梯度組(0.0?3.0 mol/L，間隔0.5)和pH梯度組(8.0?13.0，間隔1.0)的Horikoshi-Ⅰ培養(yǎng)基(n=3/組)，活化菌液接種量1.0%，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，檢測光密度值OD600。嗜堿鹽細(xì)菌分類：提取純培養(yǎng)菌株胞內(nèi)ectoine并進(jìn)行HPLC檢測。流動相：乙腈:水為80:20；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：15μL。
1.5形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定
采用Horikoshi-Ⅰ培養(yǎng)基活化純化菌株，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h；采用Horikoshi-Ⅰ固體培養(yǎng)基進(jìn)行平板劃線，觀察菌落形態(tài)。采用革蘭氏染色法對菌體染色，使用油鏡觀察菌體形態(tài)(1 000×)；采用戊二醛鋨酸雙重固定法固定菌體，使用掃描電子顯微鏡觀察菌體細(xì)胞顯微形態(tài)(8 000×)。參考細(xì)菌生化鑒定試劑盒說明書進(jìn)行碳氮源利用試驗和生理生化鑒定。
1.6分子生物學(xué)鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建
采用Horikoshi-Ⅰ培養(yǎng)基活化菌株，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，采用細(xì)菌全基因提取試劑盒提取基因組DNA并進(jìn)行16S rRNA基因PCR擴(kuò)增。引物為27F(5′-AGAGTTTGATCATG GCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGTTACCTTG TTACGAC-3′)。PCR反應(yīng)體系(30μL)：2×PCR Mix 15μL，DNA模板(10?20 ng/μL)1μL，上、下游引物(10μmol/L)各2μL，ddH2O 10μL。PCR反應(yīng)條件：95℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，33個循環(huán)；72℃5 min。PCR純化產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序。使用Lasergene v7.1軟件包對測序結(jié)果進(jìn)行拼接整理，通過NCBI數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對分析已拼接的序列，明確分離菌株的分類學(xué)地位。利用MEGA v11.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Neighbor-joining法，bootstrap為1 000。
1.7單因素試驗與發(fā)酵條件優(yōu)化
選擇ectoine發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)置6個單因素分組試驗，即NaCl濃度梯組(0.0?3.0 mol/L，間隔0.5)、Mg2+濃度梯度組(0.05?0.25 mol/L，間隔0.05)、Ca2+濃度梯度組(2.0?10.0μmol/L，間隔2.0)、MSG濃度梯度組(0.02?0.10 mol/L，間隔0.02)、CaCO3梯度組(5.0?25.0 g/L，間隔5.0)和pH梯度組(7.0?11.0，間隔1.0)。分批次檢測待測菌株胞內(nèi)的ectoine積聚量(180 r/min，48 h，n=3)，取平均值繪制曲線圖。基于單因素結(jié)果，使用Design-Expert v11.0軟件進(jìn)行Plackett-Burman和Box-Behnken多因素試驗設(shè)計。通過Plackett-Burman設(shè)計確定關(guān)鍵變量(表1)，以NaCl濃度(X1)、Mg2+濃度(X2)、Ca2+濃度(X3)、MSG濃度(X4)、CaCO3濃度(X5)作為實驗因素，以ectoine積聚量為響應(yīng)值。結(jié)合Plackett-Burman結(jié)果采用Box-Behnken法設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化方案(表1)，以ectoine積聚量為響應(yīng)值，優(yōu)化菌株培養(yǎng)基組成比例并驗證。
表1試驗因素與水平
1.8數(shù)據(jù)處理
建立ectoine檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=(X?9.819 5)/249 12，R2=0.99，式中Y為ectoine積聚量(g/L)，X為HPLC峰面積。采用SPSS v26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。
嗜堿鹽單胞菌菌株生理生化與生長特性、最優(yōu)發(fā)酵條件——摘要、材料與方法
嗜堿鹽單胞菌菌株生理生化與生長特性、最優(yōu)發(fā)酵條件——結(jié)果與分析
嗜堿鹽單胞菌菌株生理生化與生長特性、最優(yōu)發(fā)酵條件——討論、結(jié)論
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