組蛋白去乙?；敢种苿℉DI）是一類特異性抑制組蛋白去乙?；浮⒋龠M(jìn)染色質(zhì)解螺旋、增強(qiáng)其趨近性，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的小分子化合物。體內(nèi)、外研究證明組蛋白去乙?；敢种苿┛赏ㄟ^抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制腫瘤血管生成及轉(zhuǎn)移、降低腫瘤侵襲力等機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用，與放射聯(lián)合還有放射增敏作用。
近來研究表明，異羥肟酸有組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑活性，可抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。異羥肟酸被廣泛稱為低毒性HDAC抑制劑。Tambunan US等研究提出了利用苯三唑?qū)Ξ惲u肟酸修改，獲得一個(gè)更好的抑制劑。本研究觀察異羥肟酸對(duì)宮頸癌Hela和Siha細(xì)胞株生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的影響及p53mRNA和蛋白表達(dá)改變。
1.材料與方法
1.1材料
異羥肟酸購(gòu)自Sigma公司，用PBS稀釋成500mmol/L，過濾分裝，貯藏于-20℃。P53抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，為鼠抗人單抗。RPMI-1640（Gibco公司）。TRIZOL試劑購(gòu)自Invitrogen公司。新生牛血清（杭州四季青）。FACSort流式細(xì)胞儀為美國(guó)Becton Dickson公司產(chǎn)品。四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（Sigma）；AnnexinV-FITC凋亡和細(xì)胞周期分析試劑盒為Becton Dickinson公司產(chǎn)品。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)
Hela和Siha細(xì)胞株由本科室保存。細(xì)胞在5%CO2、37℃條件下，用含10%新生牛血清、青霉素（100U/ml）、鏈霉素（100U/ml）的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代。
1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)生長(zhǎng)抑制率
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期宮頸癌細(xì)胞，按細(xì)胞濃度為5×104/孔接種于96孔板。37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)24h后，分別加入不同濃度SAHA（0，1.2，2.4，5.0 mM）的培養(yǎng)基，每孔200μl，對(duì)照組不做處理。分別于加藥后0、1、2、3和4天，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃避光培養(yǎng)4h。徹底吸去MTT溶液，加入二甲基亞砜150μl/孔，震蕩10min，酶標(biāo)儀490nm激發(fā)波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度。計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值）×100%。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.3流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期
Hela細(xì)胞和Siha細(xì)胞分別用含（0，1.2，2.4，5.0 mM）SAHA的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。胰酶消化成單細(xì)胞懸液，1 000r/min離心5min收集細(xì)胞，加0.01mol/L PBS洗滌離心2次，用4℃75%乙醇固定過夜。1 000r/min離心5min，去掉乙醇固定液，PBS洗滌2次。加入PI染液1ml（50μg/mlPI、20μg/ml RNase、0.1%Triton-100），4℃孵育30min，F(xiàn)CM檢測(cè)凋亡細(xì)胞率。
1.2.4 RT-PCR檢測(cè)p53表達(dá)
分別收集用含（0，1.2，2.4，5.0 m M）SAHA處理48h的細(xì)胞。用TRIZOL提取細(xì)胞總mRNA，參照說明書進(jìn)行。提取的mRNA用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和濃度（A260/A280>1.8）。取2μg mR-NA為模板，應(yīng)用通用引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。P53引物：正義鏈5′-cctcttcggcccagtggac-3′，反義鏈5′-ccgttttcgaccctgagag-3′，退火溫度60℃，共28個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物369bp；β-actin引物：正義鏈5′-ggcatcgtgatggactccg-3′，反義鏈5′-gctggaaggtggacagcga-3′，退火溫度62℃，共28個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物594bp。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃40 s，56℃40 s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。取PCR產(chǎn)物5μl在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳（100 V，30 min）。凝膠成像系統(tǒng)成像，經(jīng)薄層掃描求得每個(gè)待測(cè)產(chǎn)物與β-actin產(chǎn)物光密度之比，進(jìn)行半定量分析。PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結(jié)果用英國(guó)UVP公司GDS8000型全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)處理。
1.6 Western blot分析p53蛋白表達(dá)水平分別收集0，1.2，2.4，5.0 m M SAHA處理72 h的細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，采用Bradford法定量蛋白質(zhì)，取50μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。然后電轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素膜上。室溫下?lián)u動(dòng)封閉4h。TBS-T洗滌3次，加一抗（p53按1∶100稀釋）在4℃下過夜。室溫下洗膜后加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)兔抗小鼠IgG抗體，洗去未結(jié)合的二抗，滴加化學(xué)發(fā)光劑ECL進(jìn)行發(fā)光顯影。TBS-T洗滌3次，再用二抗（1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG）振蕩孵育2h。采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，單變量多組資料之間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
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