銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.a)屬于非發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌，是醫(yī)院內(nèi)獲得性感染中最常見的一種條件致病菌，可引起肺炎、尿路感染以及菌血癥。當人體免疫功能低下時，例如在嚴重?zé)齻颊?、癌癥病人、術(shù)后患者以及免疫缺陷病毒感染的患者中可引起嚴重感染。2021年CHINET中國細菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，從301917份臨床分離的標本中檢出革蘭氏陰性菌占71.4％，其中銅綠假單胞菌以7.96％排名第四位。在西班牙的一項研究中，從357名急性白血病合并血流感染的患者體內(nèi)共分離出110種多重耐藥菌，其中以銅綠假單胞菌為主，整體死亡率達14.8％。在美國，10％～30％的銅綠假單胞菌分離株對碳青霉烯類抗生素耐藥，同時也是引起呼吸機相關(guān)性肺炎的主要病原體。抗生素的廣泛使用、過度使用和濫用與抗微生物藥物耐藥性的爆炸性增長有關(guān)，銅綠假單胞菌也因多重耐藥和泛耐藥被世界衛(wèi)生組織(World health organization,WHO)于2017年列入對人類健康構(gòu)成最大威脅的全球優(yōu)先病原體名單。因此，解決銅綠假單胞菌多重耐藥問題已成為當務(wù)之急。
因此，研究和開發(fā)新型抗菌藥物以解決日益嚴重的銅綠假單胞菌耐藥問題已迫在眉睫，而抗菌肽是一個選擇。
抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)是生物體內(nèi)一些具有抗菌活性的小分子多肽，在機體受感染或免疫刺激的誘導(dǎo)下產(chǎn)生，具有獨特的抗菌機制及抑菌活性，對細菌、真菌、病毒、原蟲以及腫瘤細胞等都具有一定的殺滅活性，部分具有免疫調(diào)節(jié)功能的抗菌肽甚至能夠促進傷口愈合。有研究表明，昆蟲抗菌多肽在抗藥性發(fā)展方面優(yōu)于單個肽和小分子抗生素，其獨特的抗菌機制可減少細菌耐藥性的產(chǎn)生。隨著抗生素的濫用和超級耐藥細菌的產(chǎn)生，昆蟲抗菌肽已成為設(shè)計和開發(fā)新型抗菌藥物的重要資源。
家蠅可作為抗菌肽研發(fā)的重要資源。已報道的與家蠅有關(guān)的抗菌肽包括攻擊素(attacin)、天蠶素(cecropin)、防御素(defensin)、溶菌酶(lysozyme)、雙翅肽(diptericin)等。目前，國內(nèi)外對于家蠅抗菌肽的研究主要集中在分離、純化和抗菌功能方面，對于抗菌機制的研究主要是針對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鮑曼不動桿菌、沙門菌和真菌，而關(guān)于家蠅抗菌肽對于銅綠假單胞菌的抗菌活性和作用機制尚未有報道。
在前期研究中，課題組對家蠅3齡幼蟲的全蟲轉(zhuǎn)錄組進行測序，在轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫中篩選出一條對家蠅免疫防御發(fā)揮積極作用且特異性高表達的基因，利用基因工程的方法成功合成出重組蛋白并命名為家蠅抗菌肽AMP-17(Musca domestica antimicrobialpepitides-17，AMP-17)，且對AMP-17基因進行了克隆表達、抗菌活性及時空表達模式的研究。有研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽可以與菌體細胞外膜、細胞內(nèi)膜相互作用，從而破壞膜結(jié)構(gòu)引起細菌死亡，那抗菌肽AMP-17是否也可通過類似機制發(fā)揮抗細菌活性？因此，將抗菌肽AMP-17作用于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌及銅綠假單胞菌，結(jié)果顯示均有抑制作用，其中對銅綠假單胞菌抑制作用較為明顯，且對臨床分離的耐藥銅綠假單胞菌仍有較好的抗菌活性。
但現(xiàn)有技術(shù)中，抗菌肽AMP-17通過哪些途徑發(fā)揮抗菌作用、是否破壞細菌細胞膜結(jié)構(gòu)，其抗菌作用機制尚未可知，因此需要對以上問題提出一種新的解決方案。
家蠅抗菌肽AMP-17抑制銅綠假單胞菌的研究方法，至少包括以下步驟：
S1：進行抗菌活性的檢測，抗菌活性的檢測至少包括抗菌肽AMP-17對銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測試、生長曲線的檢測、單位時間下殺菌曲線記錄、抑制生物被膜形成實驗、清除成熟生物被膜實驗和綠膿菌素的測定；
S2：進行AMP-17抗菌機制研究，AMP-17抗菌機制研究至少包括掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡、活死菌比例、外膜通透性、內(nèi)膜通透性、活性氧水平檢測；
S3：實驗每組3個平行重復(fù)，所有數(shù)據(jù)經(jīng)Graph Pad Prism 8.0.1處理后用平均值±標準差表示，T檢驗分析兩組間差異，定義P＜0.05為差異具有顯著性。
抗菌肽AMP-17對銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測試至少包括如下步驟：
將菌液在MHB肉湯培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)種2次，確保細菌的純度及活力；
取1個單克隆菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使用細菌比濁儀將菌懸液調(diào)至1×106CFU/mL備用；
將不同濃度的AMP-17與1.0×106CFU/mL菌懸液在96孔板中于37℃共同培養(yǎng)16～18小時；
從判定為MIC的孔及高于該孔藥物濃度的孔中取100μL菌液稀釋到合適濃度后在LB固體培養(yǎng)基上均勻涂布，37℃培養(yǎng)24小時，以LB固體平板上無細菌生長所對應(yīng)的抗菌肽濃度為MBC。
生長曲線的檢測至少包括以下步驟：制備1.0×106CFU/mL菌懸液，將菌懸液加入96孔板中；
與不同濃度的AMP-17共同置于37℃孵育24小時，每小時測定一次630nm處的吸光度值，記錄結(jié)果并繪制生長曲線；
以4μg/mL多粘菌素B作為陽性對照，無菌MHB作為空白對照，添加菌懸液的MHB培養(yǎng)基為陰性對照；
單位時間下殺菌曲線記錄至少包括以下步驟：以P.a CMCC 10104作為模型菌株，研究AMP-17隨時間變化對該菌作用的影響，將25μg/mL的AMP-17和50μg/mL的AMP-17與1×106CFU/mL的菌懸液在37℃下孵育24h；
當孵育0、1、2、4、6、8、10、12、24h時，從中取10μL經(jīng)AMP-17作用的菌懸液以十倍稀釋度在MHB培養(yǎng)基中連續(xù)稀釋至適當濃度；
吸取5μL稀釋液在LB固體平板上點樣，待菌落長出后計數(shù)菌落數(shù)并繪制單位時間下殺菌曲線。
表1多種抗菌藥物對銅綠假單胞菌的MIC值生長曲線的檢測：
參閱圖1，未經(jīng)AMP-17處理的對照組中P.a CMCC 10104生長曲線呈“S”型,在16小時后細菌生長到達靜止期。經(jīng)25μg/mL(1×MIC)的AMP-17作用后，P.a CMCC 10104生長在10h內(nèi)受到抑制，當使用50μg/mL(2×MIC)的AMP-17處理后，培養(yǎng)至24h P.a CMCC 10104沒有增長。
小結(jié)
通過觀察經(jīng)藥物作用后細菌胞外形態(tài)、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)、活死菌比例、外膜滲透性、內(nèi)膜通透性等改變，從形態(tài)結(jié)構(gòu)和分子水平方向?qū)咕腁MP-17對銅綠假單胞菌抗菌機制進行更便捷的研究，為設(shè)計具有良好抗菌活性的肽類抗生素提供新思路，為新型抗菌藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，為臨床治療提供新方向。
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