1.7外毒素含量測(cè)定
在1.6中測(cè)定OD600 nm值時(shí)，同時(shí)吸取適量菌液，12 000 r/min離心10 min，用0.22μm細(xì)菌濾器過濾，制得外毒素粗提取液。分別測(cè)定OD280 nm和OD260 nm值，根據(jù)蛋白濃度經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液的外毒素蛋白質(zhì)含量(ρ)。
ρ(mg/mL)=1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm
1.8同源性分析將測(cè)得的牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌16S rRNA序列與NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，在對(duì)比結(jié)果中選取來自亞洲地區(qū)且相似度較高的動(dòng)物菌株序列，下載其序列后利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
1.9 MIC測(cè)定
挑取單菌落接種于梭菌增菌液體培養(yǎng)基中，待菌液濃度生長(zhǎng)至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?OD600 nm：0.8～1.3)，用稀釋涂布平板法均勻涂布于MH培養(yǎng)基上，采用E-test法測(cè)定牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)8種常用抗菌藥物(頭孢噻肟、青霉素、復(fù)方新諾明、氨芐西林、四環(huán)素、多黏菌素B、紅霉素、慶大霉素)的MIC。MIC紙條環(huán)尖所對(duì)應(yīng)紙條上的數(shù)值就是對(duì)應(yīng)抗菌藥對(duì)細(xì)菌的最低抑菌濃度，根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行判定。
2結(jié)果
2.1牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)情況
觀察復(fù)蘇菌株在血瓊脂平板上生長(zhǎng)為表面光滑、半透明、圓屋頂樣菌落并產(chǎn)生雙溶血環(huán)(圖1)；在梭菌增菌培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后培養(yǎng)基液體由透亮的黃色變渾濁；革蘭染色鏡檢顯示，牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭陽性大桿菌，菌體呈直桿狀，兩端鈍圓，常單在或成雙排列(圖2)。
圖1牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌在血平皿上的生長(zhǎng)情況
圖2牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌革蘭染色鏡檢(1 000×)
2.2生化鑒定
牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌生化鑒定結(jié)果見表2。該菌株在葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、卵磷脂酶、乳糖、酪蛋白生化管中呈陽性反應(yīng)；在脂酶和吲哚生化管中呈陰性反應(yīng)。該菌株在石蕊牛奶中牛乳凝結(jié)物破碎后快速形成海綿樣物質(zhì)，上升到培養(yǎng)基表面，且能發(fā)酵乳糖，凝固酪蛋白并大量產(chǎn)氣，呈“洶涌發(fā)酵”現(xiàn)象。牛乳發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果符合產(chǎn)氣莢膜梭菌基本生化特征。
表2牦牛源產(chǎn)氣莢膜梭菌生化鑒定
2.3 PCR鑒定
PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見圖3，16S rRNA PCR產(chǎn)物在約1 456 bp處出現(xiàn)條帶，測(cè)序比對(duì)結(jié)果確定其為產(chǎn)氣莢膜梭菌；毒力分型PCR產(chǎn)物在196 bp和325 bp處出現(xiàn)條帶，檢測(cè)到β和α毒素，與C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素相符合，可確定菌株qinghai-12為牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌。
圖3 16S rRNA(A)和毒力分型(B)的PCR擴(kuò)增
2.4生長(zhǎng)曲線測(cè)定
牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)曲線見圖4。該菌株在接種后0～4 h內(nèi)處于遲緩期；4～8 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；8～24 h為生長(zhǎng)平衡的穩(wěn)定期；在測(cè)定期間內(nèi)未測(cè)量到衰亡期。
圖4牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)曲線
2.5外毒素含量測(cè)定
牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌不同時(shí)間點(diǎn)外毒素蛋白含量見表3，在培養(yǎng)10 h后，該菌株所產(chǎn)毒素的蛋白質(zhì)含量達(dá)4.173 mg/mL，且隨著時(shí)間的推移蛋白質(zhì)含量持續(xù)增長(zhǎng)。結(jié)果表明，牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)外毒素蛋白質(zhì)在10 h時(shí)達(dá)到最佳產(chǎn)毒時(shí)間，含量達(dá)4.173 mg/mL。
表3牦牛源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素蛋白含量
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