2.4分離株NM575的細(xì)胞嗜性
將分離株NM575接種到不同種屬的細(xì)胞。結(jié)果表明在MDBK中最敏感，生長滴度最高，TCID50/mL可達(dá)107.6；在BHK、CEF和Marc145中較敏感，TCID50/mL為105.5左右；在PK-15中也可增值，但滴度較低，TCID50/mL為101.7；在Vero-E6中不增殖（圖4）。
圖4分離病毒株NM575接種不同細(xì)胞后的TCID50
2.5分離株NM575的生長曲線
分離株NM575在感染MDBK細(xì)胞后，3~24 h內(nèi)病毒滴度不斷上升并達(dá)到高峰，24 h后稍有下降，但仍保持在高滴度水平直至本試驗(yàn)結(jié)束，即接種后48 h（圖5）。
圖5分離病毒株NM575的一步生長曲線
2.6 RT-PCR鑒定結(jié)果
以分離病毒RNA為模板經(jīng)反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA中，用牛腸道病毒引物擴(kuò)增獲得大小為1300 bp左右的特異性目的條帶，與設(shè)計(jì)引物時(shí)參考的牛腸道病毒BJ001株（HQ663846）預(yù)測的大小相符，初步證明分離株NM575為牛腸道病毒（圖6）。
圖6分離病毒株NM575 P1基因的PCR鑒定
2.7病毒分離株NM575的序列比對分析及分子進(jìn)化樹的構(gòu)建
將病毒分離株NM575 P1基因序列與GenBank中登錄的牛腸道病毒不同毒株，以及不同種屬的腸道病毒參考株的P1序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明本研究分離株NM575與牛腸道病毒BEV-261株核苷酸同源率最高，達(dá)80%。經(jīng)MEGA軟件分析表明NM575與德國牛腸道病毒分離株BEV-261處于同一分支，證實(shí)分離株為牛腸道病毒。對基因序列進(jìn)一步分析表明分離株NM575血清型屬于EV-F，基因型為EV-F1（圖7）。
圖7病毒分離株NM575的P1基因進(jìn)化樹分析
3討論
牛腸道病毒屬于小RNA病毒科、腸道病毒屬，為單股正鏈RNA病毒。它具有典型的小RNA病毒結(jié)構(gòu)，主要抗原表位也集中在結(jié)構(gòu)蛋白VP1上，但其致病力明顯弱于同屬的人腸道病毒，所以多年以來并未引起人們足夠的重視。牛腸道病毒感染宿主廣，易被感染動(dòng)物排泄在糞便中，滴度較高并且在環(huán)境中存活時(shí)間較長，對環(huán)境及水源的污染較為嚴(yán)重。牛腸道病毒在全世界較為流行，其分離源包括患有牛肺炎和痢疾、呼吸系統(tǒng)疾病及發(fā)熱、流產(chǎn)、脊髓水腫、腹瀉、出血性腸炎等疾病的牛糞便及組織樣本，這些都表明牛腸道病毒在一定程度上與一些臨床疾病相關(guān)。國內(nèi)已有5株牛腸道病毒被分離鑒定，其中3株（BHM26、BJ50和BJ001株）為EV-F2，2株（HY12與HLJ-3531/2013株）為EV-E，這些病毒均從表現(xiàn)腹瀉的牛糞便中分離獲得。
本研究中病牛表現(xiàn)精神沉郁、呼吸困難、咳嗽、流涕等癥狀，發(fā)病牛數(shù)量多、發(fā)病率高，從癥狀和流行特點(diǎn)難于判斷是由何種病原引起。國內(nèi)牛呼吸道病流行病學(xué)調(diào)查顯示，牛傳染性鼻氣管炎、牛副流感病毒3型和牛呼吸道合胞體病毒為牛主要呼吸道病毒性病原，因此對采集的30份牛鼻拭子進(jìn)行了這3種病原的核酸檢測，結(jié)果均為陰性。由于國內(nèi)還未見從患呼吸道疾病的病牛鼻拭子中分離腸道病毒的報(bào)道，所以當(dāng)時(shí)并未考慮牛腸道病毒的感染。為了查明本次疾病流行的原因，對30份牛鼻拭子用MDBK細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，結(jié)果分離出1株有CPE的病毒，命名為NM575。通過CPE、電鏡觀察和理化特性的鑒定，發(fā)現(xiàn)所分離的病毒符合小RNA病毒特點(diǎn)，因此設(shè)計(jì)牛鼻病毒和牛腸道病毒特異性引物進(jìn)行核酸鑒定，結(jié)果用牛鼻病毒引物未擴(kuò)增出條帶，而用牛腸道病毒引物擴(kuò)增出特異的陽性條帶。對陽性條帶進(jìn)行克隆測序，進(jìn)一步序列分析表明分離病毒NM575與牛腸道病毒BEV-261株核苷酸同源率高達(dá)80%。經(jīng)MEGA軟件分析，NM575與德國牛腸道病毒分離株BEV-261株處于同一分支，從而證實(shí)NM575為牛腸道病毒，為國內(nèi)首次從患呼吸道病牛的鼻拭子中分離到牛腸道病毒的報(bào)道。有報(bào)道表明牛腸道病毒感染可引起牛呼吸道疾病的暴發(fā)，所以本次牛呼吸道疾病的暴發(fā)可能是牛腸道病毒感染所致。
病毒體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，NM575可感染牛、倉鼠、豬、犬和雞等多種動(dòng)物細(xì)胞，尤其在牛源細(xì)胞中復(fù)制滴度最高，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中牛腸道病毒體外培養(yǎng)細(xì)胞嗜性相符。張海麗等研究結(jié)果表明牛腸道病毒分離株HLJ-3531/2013株能夠感染Vero細(xì)胞，而NM575在Vero-E6中不增殖。這可能是由毒株血清型的差異造成的，其中HLJ-3531/2013株為EV-E型，而本研究分離毒株為EV-F型。
2013年3月，經(jīng)國際病毒分類委員會(huì)批準(zhǔn)，重新將腸道病毒屬進(jìn)行歸類，共分為12個(gè)病毒種，牛腸道病毒被重新分為腸道病毒E（EV-E）和腸道病毒F（EV-F），其中EV-E又包括4種基因型（E1、E2、E3和E4），EV-F又分為6種基因型（F1、F2、F3、F4、F5和F6）。腸道病毒P1區(qū)主要負(fù)責(zé)編碼結(jié)構(gòu)蛋白，該區(qū)域種內(nèi)發(fā)生重組的概率很小，因此常作為腸道病毒分型的依據(jù)。本研究選取P1基因進(jìn)行了序列測定和比對以及系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示分離毒株NM575與德國分離株BEV-261核苷酸同源率最高，處于同一分支，同為EV-F，基因型為EV-F1。
結(jié)合病牛臨床癥狀、流行特點(diǎn)、病毒所致的細(xì)胞病變特征、病毒形態(tài)學(xué)特征、體外細(xì)胞培養(yǎng)嗜性和特異性RT-PCR鑒定結(jié)果，證明所分離毒株NM575為牛腸道病毒，基因分型為EV-F1。本研究結(jié)果提示我國患呼吸道疾病牛的上呼吸道中存在牛腸道病毒，為今后該病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及牛腸道病毒免疫學(xué)、致病機(jī)理和免疫預(yù)防的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
相關(guān)新聞推薦
1、新型冠狀病毒SARS-CoV2單細(xì)胞內(nèi)增殖特性與傳播動(dòng)力學(xué)模型
2、白星花金龜幼蟲新鮮蟲糞微生物菌群分離與鑒定——摘要、材料與方法
3、肺部微生物組或能幫助預(yù)測肺部移植后肺部功能的改變