摘要［目的］篩選可培養(yǎng)功能微生物，為農(nóng)業(yè)廢棄物的循環(huán)利用提供微生物資源。［方法］以喂食廢菌渣的白星花金龜幼蟲(chóng)蟲(chóng)糞為研究對(duì)象，采用平板涂布法分離蟲(chóng)糞中的可培養(yǎng)微生物，并對(duì)其分解纖維素和蛋白質(zhì)能力進(jìn)行初步探究。［結(jié)果］共分離出細(xì)菌5株、真菌3株，經(jīng)鑒定，分別為纖維化纖維微細(xì)菌、鉛黃腸球菌、原玻璃蠅節(jié)桿菌、谷氨酸桿菌、灰色鏈霉菌、熱帶假絲酵母、長(zhǎng)枝木霉和白地霉。其中纖維化纖維微細(xì)菌和灰色鏈霉菌具有降解蛋白質(zhì)的能力，在酪蛋白培養(yǎng)基上透明圈直徑與菌落直徑的比值（HC）分別為7.259±0.417和1.971±0.584；原玻璃蠅節(jié)桿菌、灰色鏈霉菌、白地霉、長(zhǎng)枝木霉具有降解纖維素的能力，在羧甲基纖維素鈉上經(jīng)剛果紅染色后透明圈HC分別為1.166±0.028、2.044±0.245、1.075±0.029、1.288±0.048。［結(jié)論］纖維化纖維微細(xì)菌、原玻璃蠅節(jié)桿菌、灰色鏈霉菌、白地霉和長(zhǎng)枝木霉可作為食用菌廢菌渣等農(nóng)業(yè)廢棄物循環(huán)利用的菌種資源。
白星花金龜（Protaetia brevitarsis），屬鞘翅目花金龜科，是一種寶貴的昆蟲(chóng)資源，在藥用、飼用、生態(tài)等方面均具有較高的利用價(jià)值。研究表明，白星花金龜幼蟲(chóng)多在腐殖質(zhì)豐富的土壤或糞堆中生活，以腐爛的秸稈、雜草以及禽畜糞便為食［1］，其幼蟲(chóng)在對(duì)秸稈進(jìn)行轉(zhuǎn)化的同時(shí)，也可以獲得蟲(chóng)體和蟲(chóng)糞等副產(chǎn)品，極具有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。白星花金龜幼蟲(chóng)對(duì)平菇菌糠、豬糞、牛糞、玉米秸稈等農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物消化率較高［2］。對(duì)東亞飛蝗糞沙、玉米秸稈、小麥秸稈和花生殼均有一定的轉(zhuǎn)化作用［3］，且獲得的幼蟲(chóng)干物質(zhì)中蛋白質(zhì)、脂肪和氨基酸含量較高［4］，蟲(chóng)糞沙也富含較多的有機(jī)物質(zhì)［5］。因此，在利用白星花金龜幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)化利用農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物的同時(shí)，不僅治理了環(huán)境問(wèn)題，還提高了蟲(chóng)體和蟲(chóng)糞沙資源的利用率。
目前有關(guān)白星花金龜幼蟲(chóng)在廢棄物循環(huán)利用方面的研究主要集中在幼蟲(chóng)對(duì)農(nóng)業(yè)廢棄物的轉(zhuǎn)化利用、農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物對(duì)幼蟲(chóng)生物學(xué)特性影響、幼蟲(chóng)腸道微生物篩選以及幼蟲(chóng)蟲(chóng)糞有機(jī)肥等方面，而對(duì)于幼蟲(chóng)蟲(chóng)糞微生物的篩選及多樣性研究鮮見(jiàn)報(bào)道。黃婉秋等［6］從白星花金龜幼蟲(chóng)腸道中分離出1株具有較強(qiáng)纖維素降解能力的纖維單胞菌，其CMC酶活性峰值能達(dá)0.19 U/mL，并確定該菌株具有包括內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡聚糖苷酶和外切葡聚糖酶等纖維素降解相關(guān)基因及代謝通路。賴(lài)德強(qiáng)等［7］將白星花金龜幼蟲(chóng)蟲(chóng)糞按比例添加在辣椒育苗基質(zhì)中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，辣椒幼苗的生物量、根系發(fā)育情況以及壯苗指數(shù)均顯著高于對(duì)照組，提高了辣椒苗期的耐寒能力。劉福順等［8］研究施用不同量白星花金龜幼蟲(chóng)蟲(chóng)糞對(duì)櫻桃蘿卜生長(zhǎng)情況的影響，結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)隨著蟲(chóng)糞施用量的增加，櫻桃蘿卜地上部、地下部鮮質(zhì)量均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。該研究以飼喂食用菌廢菌渣的白星花金龜幼蟲(chóng)為研究對(duì)象，收集其新鮮蟲(chóng)糞后采用平板涂布法分離其中的可培養(yǎng)微生物，為篩選可高效利用的微生物提供菌種資源和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料白星花金龜幼蟲(chóng)由河北燕塞生物科技有限公司提供，主要以食用菌廢菌渣為食。
1.2培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL；麥芽汁培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；酪蛋白培養(yǎng)基：酪蛋白10.00 g，牛肉浸粉3.00 g，氯化鈉5.00 g，磷酸氫二鈉2.00 g，瓊脂15.00 g，溴麝香草酚藍(lán)0.05 g，pH 7.4±0.1；羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉15.0 g，硝酸銨1.0 g，酵母膏1.0 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀1.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然；赫奇遜氏無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液：KH2PO4 1.00 g，NaCl 0.10 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，NaNO3 2.50 g，F(xiàn)eCl3 0.01 g，CaCl2 0.10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2左右；液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：玉米秸稈粉20 g，赫奇遜氏無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液1 000 mL。
1.3試驗(yàn)方法
1.3.1微生物的分離純化。
收集新鮮的幼蟲(chóng)糞沙0.1 g于無(wú)菌管中，加入0.9 mL無(wú)菌水充分混勻后，稀釋至10-2、10-3濃度梯度涂布于分離培養(yǎng)基上，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，挑取單菌落至相應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線(xiàn)培養(yǎng)，純化次數(shù)3次以上，直至獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)的單菌落。
1.3.2形態(tài)學(xué)鑒定。菌落形態(tài)觀察：將獲得的菌株挑取單菌落進(jìn)行平板劃線(xiàn)培養(yǎng)，觀察菌體在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及生長(zhǎng)情況。菌體形態(tài)觀察：染色后置于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。
1.3.3分子生物學(xué)鑒定。
1.3.3.1DNA提取。分別用Ezup柱式細(xì)菌、真菌、酵母菌基因組DNA抽提試劑盒提取相應(yīng)微生物的基因組DNA。
1.3.3.2PCR擴(kuò)增及測(cè)序。采用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，細(xì)菌引物序列27F（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG）、1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）；酵母菌引物序列NL1（GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG）、NL4（GGTCCGTGTTTCAAGACGG）；真菌引物序列ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）、ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。
1.3.4降解蛋白質(zhì)和纖維素能力初探。
將分離純化的菌株分別點(diǎn)接種至酪蛋白固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察菌株生長(zhǎng)情況及產(chǎn)生透明圈情況，并計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑的比值（HC），探究各菌株降解蛋白質(zhì)的能力。
將分離純化的菌株分別點(diǎn)接種至羧甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察菌株生長(zhǎng)情況，用剛果紅染色后觀察透明圈情況，計(jì)算透明圈HC值，探究各菌株降解纖維素的能力。
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