苯酚，又名石炭酸，最早是由德國(guó)化學(xué)家龍格在煤焦油中發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)已成為一種重要的有機(jī)化工原料，廣泛應(yīng)用于皮革生產(chǎn)、塑料制造、石油煉制和醫(yī)藥合成等工業(yè)。苯酚及其衍生物是一類芳香族化合物，釋放到環(huán)境中對(duì)人類健康和動(dòng)植物的生長(zhǎng)均會(huì)造成不利影響。隨著我國(guó)工業(yè)化進(jìn)程的加快，苯酚的需求和消耗也隨之增加，大量酚類物質(zhì)及其衍生物在土壤和水體中的排放和積累導(dǎo)致了生態(tài)環(huán)境的日趨惡化，許多國(guó)家已將其列入環(huán)境優(yōu)先控制污染物的黑名單中。因此，如何去除苯酚及其衍生物，成為了污水處理不可忽視的重要課題。
目前，清除工業(yè)廢水中苯酚的方法有很多，微生物降解因其成本低、效率高、無(wú)二次污染以及生態(tài)恢復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)而得到更廣泛的應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者已經(jīng)分離鑒定了許多不同種類的苯酚降解菌，包括紅球菌屬(Rhodococcussp.)、節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)、絲孢酵母菌屬(Trichosporonsp.)、假絲酵母菌屬(Candidasp.)、布魯氏桿菌屬(Brucellasp.)、黏質(zhì)沙雷氏菌屬(Serratiamarcescens)、泛菌屬(Pantoeasp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcus sp.)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沼澤考克氏菌(Kocuriapalustris)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌(Pseudomon-assp.)等。這些已報(bào)道的苯酚降解菌中，有的菌種對(duì)苯酚濃度的耐受度低，有的菌種降解苯酚所需的周期過(guò)長(zhǎng)，若將這些菌種用于生物法降解苯酚，還需對(duì)其做進(jìn)一步的研究，改良特性以提高對(duì)苯酚的降解能力。因此，從特殊污染環(huán)境中分離降解能力強(qiáng)、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、應(yīng)用潛力大的菌株，仍然十分必要。
本實(shí)驗(yàn)室從綿陽(yáng)某絕緣材料廠的活性污泥中分離、篩選出菌種Y_1，利用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定和16S rDNA序列分析對(duì)其進(jìn)行分類鑒定，考察了該菌株降解苯酚的能力。旨在找到能高效降解苯酚的優(yōu)勢(shì)菌株，為今后研究含酚廢水的處理方法奠定基礎(chǔ)。
1實(shí)驗(yàn)材料和方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1菌種來(lái)源
菌種來(lái)自綿陽(yáng)某絕緣材料廠的活性污泥中。
1.1.2儀器與設(shè)備
高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀、光學(xué)顯微鏡、pH計(jì)、高速冷凍離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀及電泳槽、凝膠成像儀、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。
1.1.3培養(yǎng)基
富集培養(yǎng)基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g，上述組分溶解后加蒸餾水定容至1L，將pH調(diào)節(jié)至7.0～7.2。固體培養(yǎng)基則在其原有配方中加入2%的瓊脂。
馴化篩選培養(yǎng)基：在富集培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，按實(shí)驗(yàn)需要加入相應(yīng)濃度的苯酚。
無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：K2HPO40.5g、KH2PO40.5g、NaCl 0.2g、NH4NO31g、MgSO40.2g、CaCl20.2g、FeSO4·7H2O 0.01g、MnSO4·H2O微量，苯酚(按實(shí)驗(yàn)需要加入)，加蒸餾水定容至1 L，將pH調(diào)節(jié)至7.0～7.2。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1苯酚降解菌的馴化、篩選與分離
取10g活性污泥加入100 mL蒸餾水，于30℃、200 r/min的條件下在搖床中充分振蕩半小時(shí)，靜置后取上清液10 mL，加入到100 mL苯酚濃度為100 mg/L的馴化篩選培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)三天。12 000 rpm/min離心10 min,棄上清。用生理鹽水將菌體沉淀洗滌兩次，再加入10 mL無(wú)菌水制成菌懸液。按2%的接種量接入苯酚初始濃度為100 mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，按200 mg/L的梯度依次提高苯酚濃度，直到最高濃度為1 500 mg/L。淘汰不能利用苯酚的菌株，從而篩選出能降解苯酚且對(duì)其耐受能力較強(qiáng)的菌株。經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，將培養(yǎng)液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7七個(gè)梯度稀釋，分別取100μL涂布于苯酚濃度為500 mg/L的馴化篩選培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫培養(yǎng)20 h。挑取不同形態(tài)的單菌落接種到富集培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)18h。用接種環(huán)取一環(huán)菌液，接種到富集培養(yǎng)基平板上，通過(guò)平板劃線法分離得到純菌株。
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