鬼臼毒素(Podophyllotoxin)(圖1)又名鬼臼素、鬼臼毒，是一種具抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物，屬于木脂素類，主要從鬼臼類植物(桃兒七、八角蓮、山荷葉)中分離得到。鬼臼毒素通過破壞有絲分裂細(xì)胞中的微管蛋白集結(jié)及微管的形成，使細(xì)胞有絲分裂停止在M期，抑制腫瘤細(xì)胞分裂，發(fā)揮抗腫瘤作用。瑞士Sandoz公司首先合成了鬼臼毒素的C-4位糖苷化衍生物依托泊苷(Etoposide)和替尼泊苷(Teniposide)，用于治療肺癌、淋巴癌、白血病、睪丸癌等。但鬼臼毒素具有強(qiáng)烈的毒副作用，如:導(dǎo)致貧血、脫發(fā)、胃腸道功能紊亂、骨髓抑制等，限制了其臨床使用，因此其分子結(jié)構(gòu)有進(jìn)一步修飾的必要。
圖1鬼臼毒素
為獲得結(jié)構(gòu)新穎的鬼臼毒素類活性物質(zhì)，探索它們的構(gòu)效關(guān)系，一條途徑是用化學(xué)合成方法改造其結(jié)構(gòu)，另一條途徑是微生物轉(zhuǎn)化。微生物轉(zhuǎn)化具有區(qū)域和立體選擇性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、操作簡單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，還能完成一些化學(xué)方法難以實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)，常被用于天然產(chǎn)物的化學(xué)修飾，以獲得一些結(jié)構(gòu)更合理或活性更好的類似物或衍生物。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)鬼臼毒素的微生物轉(zhuǎn)化作了一些探索，北京大學(xué)果德安教授利用青霉菌和掌葉大黃細(xì)胞轉(zhuǎn)化鬼臼毒素，使鬼臼毒素D環(huán)的反式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為順式，得到無活性的鬼臼苦素。英國諾丁漢大學(xué)Broomhead等發(fā)現(xiàn)美國金鐘連翹懸浮培養(yǎng)細(xì)胞具有將鬼臼毒素氧化為鬼臼毒酮的能力。澳大利亞墨爾本大學(xué)Teng等利用大麥懸浮培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化鬼臼毒素，得到異鬼臼苦酮。本研究從桃兒七根莖中分離出能轉(zhuǎn)化鬼臼毒素的內(nèi)生放線菌，用其轉(zhuǎn)化鬼臼毒素，獲得了1種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，經(jīng)結(jié)構(gòu)分析初步確定為4'-去甲基表鬼臼毒素，菌種鑒定為Streptomyces sp.，為進(jìn)一步研究內(nèi)生菌與鬼臼毒素的微生物轉(zhuǎn)化的機(jī)理和開發(fā)利用鬼臼毒素類活性物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1樣品采集
2010年4月中旬，于成都植物園采集桃兒七根莖樣品，樣品經(jīng)1 d左右自然風(fēng)干后進(jìn)行內(nèi)生放線菌的分離。
1.1.2培養(yǎng)基分離
培養(yǎng)基(ISP2):酵母粉4 g，麥芽提取物10 g，葡萄糖4 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH 7.3，121℃滅菌20 min;種子培養(yǎng)基/轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，酵母粉5 g，玉米漿5 g，牛肉膏3 g，F(xiàn)eCl30.05 g，KH2PO40.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO40.5 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。
1.1.3試劑
鬼臼毒素購自西安楊森制藥有限公司，純度98%;PCR試劑購自北京天根生化科技有限公司;PCR回收試劑盒、合成引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;序列測(cè)定于英俊生物科技有限公司。
1.1.4儀器島津LC-20A高效液相色譜儀;Varian Mercury-300BB型核磁共振儀;Agilent MSD Trap離子阱質(zhì)譜儀。
1.2方法
1.2.1桃兒七根莖內(nèi)生放線菌的分離
材料預(yù)處理采用75%乙醇擦拭表面及切口，并于火焰上快速烤干，風(fēng)干保存1 d左右后處理進(jìn)行內(nèi)生放線菌的分離，如近期不分離的材料則置于4℃保存。表面消毒采用Coombs等方法，使用無菌刀將消毒后的莖部組織切成1 cm2左右的小片，貼在分離培養(yǎng)基表面，留下最后一遍無菌水清洗液做涂布對(duì)照，用來檢測(cè)表面消毒效果。接種后于28℃培養(yǎng)間培養(yǎng)3～5周。約3～4周后，大多數(shù)內(nèi)生放線菌長出，無菌操作條件下用接種針挑取放線菌到ISP2平板劃線，純化后的菌株轉(zhuǎn)接到ISP2斜面活化培養(yǎng)。
1.2.2鬼臼毒素轉(zhuǎn)化菌株的篩選
將分離的內(nèi)生放線菌接種至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的搖瓶(250 mL)中，28℃振蕩培養(yǎng)3 d，然后以10%的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，發(fā)酵3 d，然后在搖瓶中加入用乙醇溶解的鬼臼毒素30 mg，繼續(xù)培養(yǎng)。每間隔1 d取10 mL包含菌絲體的發(fā)酵液，用勻漿器搗碎，利用等量的乙酸乙酯萃取，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮萃取液，用TLC和高效液相色譜(HPLC)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，篩選能對(duì)鬼臼毒素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的內(nèi)生菌株。TLC條件:展開劑為氯仿-丙酮(5∶1)，254 nm紫外顯色;HPLC條件:色譜柱為C18(4.6 mm×250 mm，5μm)，流動(dòng)相乙腈∶水=40∶60，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長230 nm。
1.2.3生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離和結(jié)構(gòu)鑒定
按上述方法對(duì)篩選獲得的內(nèi)生放線菌發(fā)酵，收集10 L發(fā)酵液，離心分離菌絲體并用勻漿器搗碎，而后與上清液合并，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，濃縮部分(5.2 g)經(jīng)過硅膠柱層析(流動(dòng)相氯仿-丙酮梯度洗脫)分離，獲得相關(guān)組分A(50 mg)，然后用制備HPLC(流動(dòng)相乙腈∶水=50∶50)純化，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物A(15 mg)，然后對(duì)其做質(zhì)譜和核磁進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
1.2.4內(nèi)生放線菌的鑒定
①菌絲形態(tài)觀察:通過掃描電鏡觀察菌絲的形態(tài)，在ISP2平板上挖1 cm寬的長方形小穴，在穴的邊緣接種，然后蓋上無菌蓋玻片，培養(yǎng)10～14 d，取出蓋玻片噴金，進(jìn)行掃描電鏡觀察;②菌落培養(yǎng)特征:選取9種培養(yǎng)基，在28℃培養(yǎng)菌株，觀察并記錄第4、7和14天菌落形態(tài)以及色素的有無和顏色等。9種培養(yǎng)基包括ISP2培養(yǎng)基、ISP3培養(yǎng)基、ISP4培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、蔗糖察氏培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、葡萄糖酵母瓊脂培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基;③生理生化特性:實(shí)驗(yàn)方法：對(duì)菌株的生長條件(溫度、pH)、NaCl耐受性、C源利用、N源利用、酯酶分解、淀粉水解、明膠液化、牛奶凝固及凍化、纖維素分解、硝酸鹽還原、MR實(shí)驗(yàn)、色氨酸分解、H2S產(chǎn)生、氧化酶和過氧化氫酶產(chǎn)生等生理生化指標(biāo)進(jìn)行了考察;④16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序:采用酶解法提取菌絲體的DNA，選用通用引物PA8:5'-CCGTCGACGAGCT CAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，PB1:5'-CCCGGGTACCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'，擴(kuò)增16S rRNA基因序列。利用上海生工生物工程公司SanPrep DNA膠回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，然后送樣、測(cè)序;⑤系統(tǒng)發(fā)育分析:將菌株的16S rRNA基因序列在NCBI上BLAST比對(duì)，再用Eztaxon數(shù)據(jù)庫對(duì)序列進(jìn)行在線分析，把相近模式菌種的序列放在一起做比對(duì)，序列比對(duì)采用Bioedit和Clustal X軟件，然后用Mega 4.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。并將測(cè)得序列提交GenBank注冊(cè)，獲得登錄號(hào)。
相關(guān)新聞推薦
1、2'-巖藻糖基乳糖作為益生元對(duì)兩歧雙歧桿菌的益生菌的影響（下）
2、在非常低的抗生素濃度下選擇耐藥性細(xì)菌：討論、材料和方法
3、希瓦氏菌：工程菌株細(xì)胞變寬對(duì)電生理的影響