討論
自然環(huán)境中的抗生素濃度可能會因特定環(huán)境而大不相同。例如，在污染制藥行業(yè)或醫(yī)院污水排放口，濃度可能達到非常高的水平（mg/ml），氟喹諾酮類藥物通常達到最高水平[19,20,21]，而在水生環(huán)境或土壤中，濃度通常要低得多[8]。所提供的數(shù)據(jù)表明，即使在抗生素濃度非常低的環(huán)境中，也可能發(fā)生耐藥菌的維持和選擇。例如，從我們的實驗中獲得的環(huán)丙沙星和四環(huán)素的MSC分別對應于100 pg/ml和15 ng/ml，類似于某些水生和土壤環(huán)境中的濃度[8]。因此，在相對原始環(huán)境中的動物中發(fā)現(xiàn)的抗生素耐藥細菌的頻率驚人地高[22,23,24]，可以想見部分原因是亞MIC選擇效應導致的富集。
這些發(fā)現(xiàn)也與阻力的可逆性問題高度相關(guān)。由于大多數(shù)抗生素耐藥機制與適應成本有關(guān)，因此有人提出，如果抗生素選擇壓力降低，耐藥的適應成本將允許易感細菌與耐藥細菌競爭。然而，大多數(shù)可用數(shù)據(jù)表明，在社區(qū)層面上，可逆性的速度將很慢或不存在[25]。有幾個因素可能導致這種不可逆性，包括不存在適應成本，通過補償突變降低適應成本，以及賦予抗性的基因與另一個被選擇基因之間的基因共選擇。此外，這里觀察到的亞MIC選擇可能是這種長期持續(xù)耐藥的重要因素，在這種情況下，環(huán)境中非常低的抗生素濃度足以通過進一步平衡耐藥的適應成本來維持種群中現(xiàn)有的耐藥細菌。這對于正常生命周期涉及土壤環(huán)境（如銅綠假單胞菌）生長或水生環(huán)境（如大腸桿菌）周期性生長的細菌病原體尤為重要。
從圖2B、D和圖3B、D、F和H中曲線的斜率可以推斷，抗性突變的適應度成本對MSC的價值有重大影響。這一成本必須首先通過抗生素對易感細菌的負面影響來克服，然后才能選擇耐藥細菌，將MSC轉(zhuǎn)移到更高濃度。降低這一成本將使曲線向上移動，并降低MSC。同樣明顯的是，突變體的抗性增加（MICsusc.和MICres.之間的差異）或者，相對于適應成本而言，耐藥模式（點突變或外排泵）對MSC幾乎沒有影響。由于我們的數(shù)據(jù)是在特定的遺傳背景下獲得的，在測試的抗生素中通常會發(fā)現(xiàn)單點突變或缺失，因此適應度成本代表了新發(fā)耐藥突變的成本。然而，在臨床上發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)耐藥菌株中，耐藥的適應成本通常通過二次突變得到補償，而不會喪失耐藥性[25]。這種適應性補償被描述為對許多不同抗生素的耐藥性，包括氟喹諾酮類藥物和鏈霉素[26,27,28]。這意味著選擇這種補償耐藥菌株的抗生素濃度甚至可能低于我們在這里測量的濃度。
我們和其他人的發(fā)現(xiàn)的另一個重要含義是，廣泛使用的突變選擇性窗口的概念需要修改。因此，在藥效學中，通常假設低于MIC的抗生素濃度不會產(chǎn)生選擇，并且突變選擇窗口（抗性突變體富集的濃度范圍）在易感野生型的MIC和抗性突變體的MIC之間延伸[11,12]。然而，我們的結(jié)果表明，生物相關(guān)的亞MIC選擇窗口要寬得多，需要包括比MICsusc低幾百倍的抗生素濃度（圖1A）。此外，本文描述的方法可用于探測不同環(huán)境中的生物活性抗生素濃度，例如動物模型。因此，通過在接受不同抗生素濃度處理的動物中進行基因標記的敏感菌株和耐藥菌株之間的競爭，可以從耐藥細菌的富集率推斷細菌生長部位的抗生素生物活性濃度。
在高于菌株MIC的選擇中，選擇的主要驅(qū)動力是抗生素耐藥性，而突變的適應成本則不那么關(guān)鍵。即使是成本非常高的突變也會被選中，因為易感細菌形式的競爭對手將被淘汰。然而，在亞MIC水平下，情況有所不同，因為易感細菌不會死亡，它們只會生長較慢。正因為如此，導致高適應成本的抗性突變不會被富集；只有適應成本低于抗生素對易感細菌的生長抑制的突變才會具有競爭力。這表明，在這種條件下，一個新的低成本或無成本耐藥突變譜可能會豐富。圖5中的數(shù)據(jù)表明，這些亞MIC水平的抗生素不僅能豐富已有的耐藥突變體，還能從易感人群中重新選擇耐藥突變體。有趣的是，盡管使用了較低的抗生素濃度，但高耐藥水平的突變體得到了富集。由于從頭突變選擇實驗中選擇的鏈霉素濃度與野生型和rpsL K42R突變之間競爭中確定的MSC濃度相同，因此富集的耐藥細菌可能攜帶耐藥突變，其適應成本顯著低于之前研究的rpsL突變。
在本實驗中，預先存在的突變體在與易感菌株的競爭中迅速富集。從數(shù)學模型中，我們可以推斷出新發(fā)耐藥突變體的類似情況，尤其是在uN.1和抗生素濃度為0.01，s，1.0的大群體中。在這些情況下，抗藥性突變體會迅速出現(xiàn)，在100-1000代的生長期內(nèi)，它們將接管種群。該模型得到了圖5和圖S2所示實驗的支持，圖5和圖S2所示實驗中，在存在亞MIC水平抗生素的情況下，在600-700代生長過程中，從頭突變的頻率不斷增加。
總之，所提供的數(shù)據(jù)表明，在許多自然環(huán)境中存在的或在治療期間在某些身體部位產(chǎn)生的非常低的抗生素水平與富集和維持預先存在的耐藥突變體以及新突變體的從頭選擇有關(guān)。這些結(jié)果強調(diào)了引入降低環(huán)境中抗生素水平的措施的重要性，以及使用治療劑量方案的重要性，該方案可防止抗生素亞MIC水平的延長時間。
材料和方法
菌株、遺傳方法和生長條件
本研究中使用的菌株來源于大腸桿菌MG1655和鼠傷寒沙門氏菌血清型LT2（文中指定為鼠傷寒沙門氏菌），并在文中S1的表S1中列出。抗性菌株是通過P22轉(zhuǎn)導（鼠傷寒沙門氏菌）或P1轉(zhuǎn)導（大腸桿菌）將抗性基因?qū)胗H本菌株而構(gòu)建的。用于細菌生長的液體和固體培養(yǎng)基為穆勒-辛頓肉湯（美國馬里蘭州貝頓·迪金森）、穆勒-辛頓瓊脂（穆勒-辛頓肉湯中添加1.5%瓊脂）和盧里亞-貝爾塔尼（LB）瓊脂（美國密蘇里州西格瑪·奧爾德里奇）。菌株在37℃下生長，液體培養(yǎng)物通過搖動通氣。
圖5。選擇抗生素亞抑制濃度下的新發(fā)耐藥突變體。共有20個獨立的鼠傷寒沙門氏菌譜系在含有1mg/ml鏈霉素的Mueller-Hinton培養(yǎng)基中連續(xù)傳代。每100代約有105個細胞被接種到含有不同濃度鏈霉素的LB瓊脂上，并計算耐藥突變體的比例。數(shù)據(jù)點按生長世代數(shù)和耐藥水平分組，在每個數(shù)據(jù)集中，一個數(shù)據(jù)點代表一個譜系中能夠在指定抗生素濃度下生長的細胞比例。請注意，基線處的數(shù)據(jù)點將重疊。doi:10.1371/期刊。ppat。1002158.g005
增長率測量
使用Bioscreen C分析儀（Oy Growth Curves Ab Ltd，芬蘭赫爾辛基）在37℃的Mueller Hinton肉湯中測量生長率，無論是否存在四環(huán)素。每口井接種1000倍稀釋的過夜培養(yǎng)物，并在每種抗生素濃度下進行四次測量。培養(yǎng)物在連續(xù)搖動下生長24小時，每4分鐘測量一次OD600。計算基于OD600值在0.02和0.1之間，其中生長呈指數(shù)增長。敏感菌株（DA6192）和耐藥菌株（DA17822）在單獨的實驗中生長，相對生長率的計算方法為衍生生長率除以不使用抗生素生長的同一菌株的生長率。
圖6。適應性突變的固定時間。（A）當N=107且從上到下，u=1029、1028、1027和1026最初不存在突變體時，50%的穿透時間作為選擇系數(shù)的函數(shù)。紅線來自公式（4）和隨機模型的交叉點，即公式（Eqs）。（7）–（10），m0=0。（B）。當突變體的初始存在由突變選擇平衡決定時，50%的穿透時間作為選擇系數(shù)的函數(shù)，m0=Nf0=uN/|s0|。結(jié)果是s0=20.02，N=107，從上到下，u=102610271028。紅線來自公式（6），交叉點來自隨機模型Eqs。(7)–(10).doi:10.1371/期刊。ppat。1002158.g006
麥克風測量
四環(huán)素和環(huán)丙沙星的MIC測定通過10毫升試管中的肉湯大稀釋進行。在含有添加了不同濃度抗生素的米勒萊茵頓肉湯（1ml）的試管中接種1ml在37℃下生長的過夜細菌培養(yǎng)物。試管在37攝氏度下?lián)u動培養(yǎng)16至18小時，四環(huán)素培養(yǎng)物避光以避免抗生素降解。MIC設置為抗生素的最低濃度，不會產(chǎn)生可見的生長。根據(jù)制造商（瑞典索爾納AB bioMerieux）的說明，通過Etest測定鏈霉素的MIC。在37℃下培養(yǎng)16-18小時的穆勒-辛頓瓊脂平板上進行ETEST試驗。
競爭實驗
競爭對手（103個細胞）的有限抽樣通常會在競爭實驗中引入統(tǒng)計上的不確定性，借助綠色熒光蛋白基因（gfp）的青色（cfp）或黃色（yfp）變體的染色體拷貝，可以獲得更精確的抗藥性突變體與野生型細胞比率的測量。它們允許使用熒光激活細胞分選機（FACS）跟蹤大量單個細胞（105個細胞）。如前所述[29]，使用l-Red系統(tǒng)將cfp/yfp基因插入galK，并通過噬菌體P22轉(zhuǎn)導或噬菌體P1轉(zhuǎn)導將其轉(zhuǎn)移到各種菌株中。
在帶有cfp或yfp的易感野生型菌株的Mueller-Hinton培養(yǎng)基中培養(yǎng)的隔夜培養(yǎng)物，混合比例為1:1、10:1、102:1，103:1和104:1，同基因抗性突變體攜帶另一個標記，每24小時通過1000倍連續(xù)稀釋（導致每個連續(xù)傳代10代生長）維持，最多4到6個連續(xù)傳代。通過使用熒光激活細胞分類儀（BD FacsAria）計數(shù)105個細胞，在每個連續(xù)傳代時確定群體中耐藥細胞與敏感細胞的比率。選擇系數(shù)是使用回歸模型s=[ln（R（t）/R（0））]/[t]確定的，如前所述[30]，其中R是抗性與易感的比率。該方案允許重復測定小到s=0.003[17]的適應度差異。每個野生型菌株的兩個獨立構(gòu)建的集合（用cfp或yfp標記）也被包括在內(nèi)，以測量與yfp相比，使用cfp標記對生長率的相對影響。這些對照實驗表明，經(jīng)過40代的競爭，標記之間的成本差異對生長率的影響可以忽略不計。（圖S1）。由于新出現(xiàn)的四環(huán)素抗性突變體的出現(xiàn)需要很長時間，可能會干擾競爭實驗，因此使用低初始比例的抗性突變體進行的競爭實驗是用四環(huán)素完成的。
新進化抗性突變體的富集
為了研究亞抑制性抗生素濃度是否也能選擇新產(chǎn)生的耐藥突變株，敏感細菌在鏈霉素MIC的1/4和環(huán)丙沙星MIC的1/10處連續(xù)傳代。在含有1mg/ml鏈霉素的Mueller-Hinton培養(yǎng)基中，共有20個鼠傷寒沙門氏菌LT2的獨立譜系通過每24小時1000倍稀釋在1ml分批培養(yǎng)基中連續(xù)傳代700代（每連續(xù)傳代10代），在含有2.3ng/ml環(huán)丙沙星的Mueller-Hinton培養(yǎng)基中，20個獨立的大腸桿菌MG1655在1ml分批培養(yǎng)基中每24小時進行1000倍稀釋，連續(xù)傳代600代。這些譜系是從獨立群體的隔夜培養(yǎng)開始的，最初的瓶頸是大約104個細胞，以盡量減少先前存在的抗性突變體的數(shù)量。通過每100代將大約105個細胞接種到含有不同濃度抗生素的LB瓊脂上，并計數(shù)菌落數(shù)，監(jiān)測每個培養(yǎng)基中耐藥細胞的百分比。這些細胞的一個子集在相同的抗生素濃度下被重新破裂，以確認它們具有耐藥性。
支持信息
圖S1用yfp或cfp標記的兩種野生型S型鼠傷寒菌株之間的競爭實驗（菌株DA15110和DA15111，文本S1中的表S1）。每條線代表一個實驗（四場比賽的平均值），共進行了四個獨立實驗。（TIF）
圖S2抗生素亞抑制濃度下新發(fā)耐藥突變體的選擇。共有20個獨立的大腸桿菌MG1655菌株在含有2.3 ng/ml環(huán)丙沙星的Mueller-Hinton培養(yǎng)基中連續(xù)傳代。每100代約有105個細胞被接種到含有不同濃度環(huán)丙沙星的LB瓊脂上，并計算耐藥突變體的比例。數(shù)據(jù)點按生長世代數(shù)和耐藥水平分組，在每個數(shù)據(jù)集中，一個數(shù)據(jù)點代表一個譜系中能夠在指定抗生素濃度下生長的細胞比例。請注意，基線處的數(shù)據(jù)點將重疊。（TIF）
文本S1包含表S1（菌株的基因型和MIC）、表S2（指數(shù)增長率數(shù)據(jù)）、表S3（競爭數(shù)據(jù)）和附錄（適應性突變的固定時間）。（博士）
作者構(gòu)思并設計了實驗：LS-DH-DIA。進行實驗：例如CS OGB CI。分析數(shù)據(jù)：如LS OGB DH DIA。寫這篇論文的人：例如。
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