電能細(xì)胞是一類能夠與外界環(huán)境或其他細(xì)胞進(jìn)行電子交換的電活性微生物。其廣泛分布于細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌中，目前已分離篩選出上百種具有電活性的微生物，包括向外界環(huán)境釋放電子的“產(chǎn)電細(xì)胞”，以及從外界環(huán)境獲取電子的“噬電細(xì)胞”。以電能細(xì)胞為核心構(gòu)建的多種微生物電催化系統(tǒng)，為解決我國(guó)能源和環(huán)境等重大需求，提供了極具發(fā)展?jié)摿Φ慕鉀Q方案，也是國(guó)際學(xué)術(shù)研究前沿的熱點(diǎn)和新興領(lǐng)域。
迄今為止，有兩種胞外電子傳遞機(jī)制被廣泛認(rèn)可。即通過外膜c型細(xì)胞色素或?qū)щ娂{米線與電極進(jìn)行直接接觸電子傳遞，以及通過可溶性電子傳遞載體（如黃素類、吩嗪類、醌類等）與電極之間進(jìn)行間接地電子傳遞。奧奈達(dá)希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1作為一種經(jīng)典的模式電能細(xì)胞，主要通過Mtr途徑進(jìn)行直接電子傳遞和核黃素進(jìn)行間接電子傳遞，目前已有不少研究致力于通過合成生物學(xué)策略強(qiáng)化S.oneidensis MR-1的胞外電子傳遞速率。當(dāng)前的合成生物學(xué)改造策略主要致力于拓寬底物利用譜、提升胞內(nèi)電子池、過表達(dá)細(xì)胞色素、增強(qiáng)可溶性電子載體合成、強(qiáng)化生物膜形成以及增強(qiáng)全局調(diào)控等，都起到了提高產(chǎn)電的正向效果。
近年來，通過調(diào)控基因來改造細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)的形態(tài)工程成為改進(jìn)生物制造的一種新方法。這些與細(xì)胞形態(tài)相關(guān)的基因同時(shí)參與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞伸長(zhǎng)或細(xì)胞分裂，因此細(xì)胞形態(tài)也受到細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長(zhǎng)等過程的調(diào)控。通過形態(tài)工程，細(xì)菌細(xì)胞的形狀可以如預(yù)期的那樣從桿狀變化到球形，或者由小到大。這些形態(tài)變化隨后影響細(xì)胞生長(zhǎng)代謝速率，從而影響小分子產(chǎn)物合成與分泌、以及包涵體產(chǎn)物的積累和分離。
目前已有很多研究將細(xì)菌形態(tài)工程用于化學(xué)品，如乙偶姻、聚羥基脂肪酸酯和聚乳酸-3-羥基丁酸酯的生產(chǎn)。然而，探究細(xì)胞尺寸和細(xì)胞能量代謝兩間的關(guān)系的研究較少。最近的一項(xiàng)研究顯示，用細(xì)胞分裂抑制劑順鉑處理電活性微生物S.oneidensis MR-1可將桿狀細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)的絲狀形態(tài)，這將輸出電流密度從野生型111 mA/m2提高到順鉑處理后646 mA/m2。盡管如此，操縱細(xì)胞尺寸的方法及其對(duì)細(xì)胞電生理的具體調(diào)控機(jī)制尚未建立。
因此，本文運(yùn)用合成生物學(xué)策略對(duì)模式產(chǎn)電微生物希瓦氏菌S.oneidensisMR-1進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)改造，通過表達(dá)反義RNA抑制細(xì)胞伸長(zhǎng)體形成相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控控制細(xì)胞寬度的伸長(zhǎng)體，構(gòu)建了4種不同寬度的工程菌株，通過電化學(xué)、生理代謝并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)從胞內(nèi)電子產(chǎn)生、胞外電子轉(zhuǎn)移和電活性生物膜形成三個(gè)方面，系統(tǒng)地闡明了細(xì)胞變寬對(duì)電生理的影響。為提高希瓦氏菌的電子傳遞效率提供有效工程策略。
希瓦氏菌概述
提到發(fā)電方式，多數(shù)人可能會(huì)想到火力、水力、風(fēng)力、太陽(yáng)能、核能等途徑。然而，微生物發(fā)電這一較為冷門的領(lǐng)域卻擁有近百年的研究歷史。早在1911年，英國(guó)生物學(xué)家Michael Potter便已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在含有釀酒酵母或特定細(xì)菌的培養(yǎng)液中使用鉑作為電極，有機(jī)物的分解過程可以生成電流。
在生物發(fā)電領(lǐng)域，希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）MR-1堪稱一名“明星”細(xì)菌。該細(xì)菌最初在Oneida湖中被分離出來，并因其獨(dú)特的錳還原（Manganese Reducing，簡(jiǎn)稱MR）能力而得名。
希瓦氏菌的表面（來源：《科學(xué)》雜志）
在進(jìn)行錳還原的過程中，希瓦氏菌通過細(xì)胞膜上的特殊導(dǎo)電蛋白生成電流，從而獲取所需的能量。值得注意的是，該細(xì)菌能夠在高濃度重金屬的厭氧環(huán)境中生存，研究還表明它具有將汞離子還原為汞單質(zhì)，以及將銀離子還原為銀單質(zhì)的能力。
那么，希瓦氏菌MR-1為何具有天然的導(dǎo)電特性呢？
科學(xué)家將具有自發(fā)進(jìn)化胞外電子轉(zhuǎn)移（Extracellular Electron Transfer，簡(jiǎn)稱EET）途徑的微生物稱作外產(chǎn)電菌。其中，最受研究者們關(guān)注的EET途徑便是希瓦氏菌MR-1的金屬還原（Metal-reducing，簡(jiǎn)稱Mtr）途徑。
在這一途徑中，電子通過細(xì)胞膜和周質(zhì)空間內(nèi)的特殊細(xì)胞色素進(jìn)行傳遞，這些細(xì)胞色素上堆疊著密集的血紅素分子。
然而，盡管這些外產(chǎn)電菌在將底物轉(zhuǎn)化為電能的過程中展現(xiàn)出較高的效率，它們對(duì)底物（即食物）特別挑剔，適應(yīng)性相對(duì)較差。
此外，由于缺乏有效的遺傳操作工具，進(jìn)行基因改造以提高其應(yīng)用范圍和效率變得相對(duì)困難。這些因素在一定程度上限制了包括希瓦氏菌MR-1在內(nèi)的外產(chǎn)電菌的廣泛應(yīng)用。
為探究反義RNA技術(shù)對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)錄抑制水平，工程菌株的轉(zhuǎn)錄水平采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（quantitative reverse transcription-PCR，qRT-PCR）進(jìn)行驗(yàn)證。
具體操作如下：取工程菌株不同生長(zhǎng)時(shí)期的二級(jí)種子液，在4°C、5000×g離心5min后，用液氮快速冷凍，使用干冰低溫寄樣交由北京躍麗軒科技有限公司進(jìn)行qRT-PCR。參比基因選擇編碼DNA旋轉(zhuǎn)酶的gyrB基因。轉(zhuǎn)錄水平通過參比基因gyrB使用2(-ΔΔCT)方法進(jìn)行歸一化處理。
結(jié)果顯示，工程菌株的具有更高的水接觸角，其中菌株AsmreC為23.27°，菌株AsrodZ為31.80°，菌株AsmreB為32.62°，菌株AsmreD為34.98°，均高于WT的18.78°。這是因?yàn)楣こ叹甑募?xì)胞表面多糖的減少，導(dǎo)致細(xì)胞表面疏水性增強(qiáng)，從而使得水接觸角的增大，這有助于生物膜形成初始階段的表面附著過程。細(xì)胞寬度的增加使細(xì)胞變得更接近于球狀，球狀細(xì)胞相對(duì)桿狀細(xì)胞更有助于生物膜的垂直擴(kuò)展，從而增加生物膜的厚度。
電化學(xué)阻抗譜掃描表明變寬菌株的生物膜導(dǎo)電性更強(qiáng)，內(nèi)阻更低。與此同時(shí)，變寬工程菌株AsmreB和AsmreD的EDC和EAC明顯高于WT，表明工程菌株生物膜的電活性也更高。上述結(jié)果表明，胞的擴(kuò)寬不僅增強(qiáng)了基于c型細(xì)胞色素的直接EET，還有助于電活性生物膜形成的初始粘附和垂直擴(kuò)展過程。
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