摘要：以64倍最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的氨芐西林、環(huán)丙沙星、多粘菌素三種抗菌藥物分別處理大腸桿菌ATCC 25922，去除藥物后，保持原始菌株藥物敏感性的存活菌株為持留菌株;另用濃度遞增的亞致死量的三種抗菌藥物培養(yǎng)基連續(xù)對(duì)大腸桿菌ATCC 25922進(jìn)行分批培養(yǎng)，獲得能夠耐受一定藥物濃度的抗藥性增強(qiáng)的菌株，去除藥物后，菌株穩(wěn)定的MIC值仍顯著高于原始菌株，為抗藥菌株。以穩(wěn)定的MIC范圍為檢測(cè)指標(biāo)，比較原始菌株的持留菌株和抗藥菌株后續(xù)的生長優(yōu)勢(shì)。結(jié)果表明：經(jīng)過一段時(shí)間的混合培養(yǎng)，持留菌株在95%以上，數(shù)量上占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，說明持留菌株比抗藥菌株具有更強(qiáng)的生長優(yōu)勢(shì)，由此引發(fā)對(duì)抗藥性回復(fù)的重新思考，自然界中持留菌株的特性、形成及存在可能為抗藥性的逆轉(zhuǎn)預(yù)留了一條途徑。
抗菌藥物的發(fā)現(xiàn)和使用大大降低了細(xì)菌感染性疾病導(dǎo)致的死亡率，但隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，人類和動(dòng)物病原菌的抗藥性問題凸顯并引起全球高度關(guān)注[1]?？咕幬锸褂弥蹙陀邢嚓P(guān)抗藥性的報(bào)道，至今有關(guān)細(xì)菌抗藥性的起源、發(fā)展和傳播已有了相當(dāng)?shù)姆e累。研究表明細(xì)菌抗藥性可以通過多種機(jī)制產(chǎn)生，如編碼靶蛋白的基因突變、藥物滲透降低、細(xì)菌外排泵的外排功能激活、靶蛋白旁路、非酶的靶位保護(hù)、酶靶位修飾等，細(xì)菌通過整合各種可能的機(jī)制形成抗藥性表型，并且可遺傳的抗藥性能夠通過可移動(dòng)遺傳因子進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移[2]，尤其在抗菌藥物選擇壓力下，越來越多的“超級(jí)細(xì)菌”逐漸產(chǎn)生，對(duì)人類健康造成巨大威脅[3]。
細(xì)菌的持留性（persistance）不同于抗藥性，表型上，持留菌雖然也能夠耐過遠(yuǎn)高于MIC的藥物濃度得以存活，卻保留了原始菌株的藥物敏感特性。早在1944年，Bigger發(fā)現(xiàn)青霉素并不能完全殺死金黃色葡萄球菌，其中極小一部分可以存活，認(rèn)為其表現(xiàn)為休眠狀態(tài)、非可遺傳表型[4]。抗菌藥物可以殺死大部分細(xì)菌，但總有一小部分不能被抗菌藥物殺滅，當(dāng)這些存活的亞群在同樣的抗菌藥物條件下生長，會(huì)重復(fù)這種異質(zhì)特性，這種現(xiàn)象叫做細(xì)菌持留性，存活的細(xì)菌叫做持留菌[5]。持留菌的形成機(jī)制尚不明確，目前已有的研究包括持留性相關(guān)基因如hipA[6]、毒素/抗毒素（TA）系統(tǒng)[7]和外排泵系統(tǒng)[8]等，與細(xì)菌抗藥性一樣，持留性也是多因素共同參與形成的。
持留菌和抗藥菌的本質(zhì)和形成機(jī)制不同，但共存于抗菌藥物壓力下的細(xì)菌群體中。在對(duì)持留菌的研究中，普遍認(rèn)為持留菌在抗藥性中起到了至關(guān)重要的“幫兇”作用，研究思路多為阻斷持留菌的形成和阻止進(jìn)入休眠狀態(tài)[6-8]。而本文思路是從生態(tài)角度審視抗菌藥物使用過程中，休眠的持留菌在抗藥性回復(fù)中可能的作用及當(dāng)去除藥物后二者在菌群后續(xù)繁殖中各自發(fā)揮怎樣的作用。在體外條件下采用氨芐西林、環(huán)丙沙星和多粘菌素三種不同類型的常用抗菌藥物，以不同方式對(duì)原始菌株進(jìn)行處理，獲得原始菌株的持留菌株和抗藥菌株，比較其藥敏特性和相同生態(tài)環(huán)境中的生長優(yōu)勢(shì)，并探討持留菌存在的意義及其在抗藥性回復(fù)中潛在的作用。
1、材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
菌株：藥物敏感性試驗(yàn)質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC 25922，由山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。
試劑與藥品：氨芐西林、環(huán)丙沙星和多粘菌素，購自中國藥品生物制品檢定所，分析純;MH液體培養(yǎng)基（MHB）、MH固體培養(yǎng)基（MHA），購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1 MIC測(cè)定根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）建立的標(biāo)準(zhǔn)藥敏方法，采用微量肉湯稀釋法[9]，測(cè)定原始菌株、持留菌及抗藥菌株對(duì)氨芐西林、環(huán)丙沙星、多粘菌素三種抗菌藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。
1.2.2高藥物濃度下獲得持留菌株用微量肉湯稀釋法測(cè)定
大腸桿菌ATCC 25922 MIC后，在96孔板上，將氨芐西林、環(huán)丙沙星和多粘菌素的藥物濃度分別設(shè)置為各種藥物MIC的64倍（氨芐西林256μg/mL，環(huán)丙沙星1μg/mL，多粘菌素32μg/mL），按照藥敏試驗(yàn)方法的接種量接入穩(wěn)定期大腸桿菌ATCC 25922，每種藥做18個(gè)重復(fù)孔，37℃靜置培養(yǎng)。分別于6 d內(nèi)每天取3個(gè)重復(fù)樣，將每孔液體共200μL全部取出，10 000 r/min離心5 min，用200μL生理鹽水洗滌2次，加50μL生理鹽水重懸后涂布MHA平板，培養(yǎng)24～48 h，計(jì)算菌落數(shù)，測(cè)定MIC。
1.2.3在遞增的亞致死量藥物濃度下分批傳代
獲得抗藥菌株取大腸桿菌ATCC 25922接種于裝有50 mL MHB的三角瓶中（接種量為1%，V/V），氨芐西林、環(huán)丙沙星和多粘菌素的終濃度分別為各自的1/2 MIC，12 h后轉(zhuǎn)接到下一個(gè)三角瓶中（藥物濃度不變），培養(yǎng)12 h后再轉(zhuǎn)接到藥物濃度倍增的三角瓶中;藥物濃度由1/2 MIC連續(xù)倍比遞增至64倍MIC，每一濃度傳代2次，第二次培養(yǎng)細(xì)菌生長后劃線于含相同濃度藥物的MHA平板，過夜培養(yǎng)，挑取生長良好的單菌落并測(cè)定MIC。然后將其在無藥MHB中連續(xù)傳代直至MIC穩(wěn)定，獲得一系列MIC穩(wěn)定的抗藥性增強(qiáng)的菌株。
1.2.4持留菌株與抗藥菌株的生長曲線測(cè)定
將獲得的原始菌的持留菌株和抗藥菌株在島津2500 UV-VIS光譜儀中37℃培養(yǎng)900 min，每15 min在線連續(xù)測(cè)量OD600，比較不同菌株的生長曲線是否存在差異。
1.2.5持留菌株和抗藥菌株的MIC范圍
分別選取氨芐西林、環(huán)丙沙星和多粘菌素三種藥物原始菌的持留菌株和抗藥菌株，挑取單菌落分別接種于等體積的MHB中，以同樣的條件振蕩培養(yǎng)16～18 h，各取菌液1 mL稀釋至適當(dāng)濃度，涂布于MHA平板獲得單菌落，各取100個(gè)單菌落進(jìn)行MIC測(cè)定[9]，統(tǒng)計(jì)不同菌株各自的MIC分布范圍。
1.2.6持留菌株和抗藥菌株生長優(yōu)勢(shì)的比較
根據(jù)1.2.5中測(cè)定的MIC頻率分布結(jié)果，選取各自MIC范圍沒有交叉的持留菌株和抗藥菌株，等比例接種培養(yǎng)基混合培養(yǎng)，以各自MIC為檢測(cè)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)二者組成比例的變化。具體方法：挑取氨芐西林、環(huán)丙沙星和多粘菌素的持留菌株和抗藥菌株的單菌落，分別接種于MHB中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，用MHB稀釋，于紫外-可見光分析儀（GE Ultrospec 3100 pro）檢測(cè)OD600，調(diào)節(jié)至0.08～0.10范圍內(nèi)，盡量調(diào)整稀釋倍數(shù)使其最終達(dá)到相同的OD600值，確保小數(shù)點(diǎn)后兩位相同。以此濃度各取500μL，同時(shí)接種于含有100 mL MHB的三角瓶中，等比例接種后混合振蕩培養(yǎng)，每天取1 mL轉(zhuǎn)接入新的100 mL MHB中，連續(xù)轉(zhuǎn)移傳代7 d甚至更長時(shí)間。每次培養(yǎng)后取混合菌液稀釋至合適濃度，涂布獲得單菌落100株，測(cè)定其MIC。以1.2.5中測(cè)定的MIC頻率分布為指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)菌液中持留菌株和抗藥菌株來源的大腸桿菌的比例。
原始菌株、持留菌及抗藥菌株藥敏特性和生長優(yōu)勢(shì)比較（一）
原始菌株、持留菌及抗藥菌株藥敏特性和生長優(yōu)勢(shì)比較（二）
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