2、結(jié)果與分析
2.1高藥物濃度下獲得持留菌株
在高藥物濃度的培養(yǎng)條件（氨芐西林256μg/mL，環(huán)丙沙星1μg/mL，多粘菌素32μg/mL）下，持續(xù)作用6 d，依然能夠檢測到存活的細(xì)菌。按照接種量104 cfu/mL數(shù)量級(jí)計(jì)算，存活率在0.1%左右（表1）。此試驗(yàn)結(jié)果表明，即使在有限的空間內(nèi)，只要初始接種量達(dá)到一定數(shù)量，高于致死濃度的抗菌藥物并不能完全殺死細(xì)菌，總會(huì)有一小部分細(xì)菌存活下來。
在藥物氨芐西林濃度為256μg/mL條件下，先后共收集存活的細(xì)菌134株，測定其MIC，90%以上的菌株與原始菌株持平，少數(shù)略高于原始菌株一個(gè)或兩個(gè)梯度，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其生存環(huán)境的藥物濃度。環(huán)丙沙星和多粘菌素作用下的群體也存在同樣的現(xiàn)象（數(shù)據(jù)略）。這些在高濃度藥物作用下存活的細(xì)菌，其MIC卻保持不變，為持留菌。致死量的抗菌藥物不能將其殺滅，說明持留菌通過某種機(jī)制耐過了高濃度的藥物，并且保持了原有的藥物敏感特性。隨機(jī)選取其中一株氨芐西林的持留菌，在氨芐西林濃度為256μg/mL的環(huán)境中得以存活，測定其分裂繁殖的后代實(shí)際MIC為4μg/mL，經(jīng)傳代后MIC保持不變，命名為菌株P(guān)-A，是原始菌株持留菌株繁殖后代的純培養(yǎng)。
用同樣的方法獲得環(huán)丙沙星和多粘菌素作用下的持留菌株，分別耐過的藥物濃度為1μg/mL和32μg/mL，保持原始菌株的MIC分別為0.0156μg/mL和0.5μg/mL不變。
2.2在遞增的亞致死量藥物濃度下傳代獲得抗藥菌株
在藥物選擇壓力不斷提高的試驗(yàn)條件下獲得一系列抗藥性增強(qiáng)的菌株，能夠在相應(yīng)藥物濃度下繼續(xù)生長繁殖。這些菌株的MIC值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于原始菌株MIC。由于存在多種形成機(jī)制，在藥物去除后有些抗藥機(jī)制關(guān)閉，而有些抗藥機(jī)制是穩(wěn)定的，因此，在無藥培養(yǎng)基中連續(xù)傳代后，抗藥菌株的MIC值有不同程度的回落，但都難以回復(fù)到原始菌株的敏感性。
經(jīng)遞增的亞致死量氨芐西林連續(xù)培養(yǎng)后，選取一株MIC穩(wěn)定的耐過氨芐西林256μg/mL的抗藥菌株，傳代后MIC穩(wěn)定在128μg/mL，是原始菌株MIC的32倍，命名為R-A。
用同樣的方法獲得環(huán)丙沙星和多粘菌素的抗藥菌株，選取耐過1μg/mL環(huán)丙沙星和32μg/mL多粘菌素的抗藥菌株，穩(wěn)定的MIC分別為0.5μg/mL和8μg/mL。
2.3持留菌株和抗藥菌株的MIC范圍
MIC值表示菌株對(duì)藥物的敏感程度，是一個(gè)群體概念。由于細(xì)菌群體具有異質(zhì)性，純培養(yǎng)的細(xì)菌群體中小亞群的MIC也可能有所差異。因此，MIC并非一個(gè)準(zhǔn)確的數(shù)值，而是一個(gè)范圍。為了后續(xù)比較生長優(yōu)勢(shì)，先檢測各類菌株的MIC范圍，分別取100個(gè)單菌落測定MIC分布情況。氨芐西林藥物處理的菌株MIC統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2，P-A的MIC分布峰值為4μg/mL，MIC與原始菌株持平;R-A的MIC分布峰值為128μg/mL，是原始菌株MIC的32倍。經(jīng)過傳代培養(yǎng)證明，兩個(gè)菌株的MIC范圍是穩(wěn)定的表型指標(biāo)，可以作為判定菌株性質(zhì)的指標(biāo)。對(duì)環(huán)丙沙星和多粘菌素處理菌株的穩(wěn)定MIC范圍也按同樣的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（數(shù)據(jù)略）。
2.4持留菌株和抗藥菌株生長優(yōu)勢(shì)的比較
經(jīng)檢測，不同藥物作用下篩選的兩類菌株的生長曲線并無明顯差異（生長曲線圖略），因此可采取混合培養(yǎng)的方式，以各自MIC為衡量指標(biāo)比較其生長優(yōu)勢(shì)。
氨芐西林處理的P-A和R-A菌株MIC范圍無相互交叉，將二者等比例混合接種培養(yǎng)，根據(jù)穩(wěn)定的MIC范圍統(tǒng)計(jì)其比例變化。如圖1所示，混合培養(yǎng)后，持留菌株P(guān)-A所占比例逐漸升高，到第4 d增至70%以上，至第7 d抗藥菌株R-A比例低于5%，菌株P(guān)-A數(shù)量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。此結(jié)果表明，在沒有藥物的培養(yǎng)條件下，P-A具有更強(qiáng)的生長優(yōu)勢(shì)。隨機(jī)挑選氨芐西林作用下存活的其它持留菌株和抗藥菌株，用同樣的方法對(duì)比其生長優(yōu)勢(shì)，也有類似的結(jié)果（數(shù)據(jù)略）。另外兩種藥物環(huán)丙沙星和多粘菌素的持留菌株和抗藥菌株，生長優(yōu)勢(shì)的比較也存在類似結(jié)果（數(shù)據(jù)略），最終都能體現(xiàn)出持留菌株具有更強(qiáng)的生長優(yōu)勢(shì)。本研究中共檢測8組菌株的對(duì)比，未檢測到例外情況。
3、討論與結(jié)論
3.1細(xì)菌抗藥性的意義
抗菌藥物的廣泛應(yīng)用是篩選與富集抗藥菌株的主要推動(dòng)力，卻并非抗藥性產(chǎn)生的根源[10]。抗藥基因廣泛而普遍地存在于環(huán)境中—病原菌、共生菌及多種環(huán)境微生物[11]。越來越多的研究表明，抗藥性是細(xì)菌的一個(gè)自然屬性[12]，徹底消除抗藥性是不可能的。由于細(xì)菌遺傳物質(zhì)的自發(fā)突變、藥物壓力的篩選和誘導(dǎo)、復(fù)雜多樣的抗藥性機(jī)制、不可避免地與周圍環(huán)境微生物接觸等眾多因素，即使在有限的空間內(nèi)和特定條件下也難以完全消除細(xì)菌抗藥性。從另一個(gè)方面看，抗藥性對(duì)于細(xì)菌本身而言則意味著物種能夠克服環(huán)境抗菌藥物壓力得以延續(xù)和存活，對(duì)環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性和穩(wěn)定性起到了重要作用，對(duì)動(dòng)物（包括人）免疫系統(tǒng)的形成、健康乃至整個(gè)生態(tài)環(huán)境都具有重大影響[13，14]。
細(xì)菌的抗藥性為菌株提供了額外的生物學(xué)特性，幫助提高微生物對(duì)特定環(huán)境的適應(yīng)性，同時(shí)多數(shù)情況下會(huì)付出一定的抗性代償，包括生長繁殖能力降低。因此，理論上原始菌株比抗藥菌株具有更強(qiáng)的生長優(yōu)勢(shì)，但在抗菌藥物壓力下具有更強(qiáng)生長優(yōu)勢(shì)的原始敏感菌被殺死，而抗藥菌株的敏感性回復(fù)則是復(fù)雜漫長的過程[15]。
3.2持留菌的存在及在抗藥性回復(fù)中的潛力
在林林總總的抗藥表型和抗藥機(jī)制中，持留菌以其獨(dú)特的機(jī)制引起人們的注意。持留菌通過“休眠-恢復(fù)生長-增殖”的方式維持自身的生存和菌體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，巧妙躲過外界惡劣環(huán)境的影響而存留下來，但依然保持著原始菌株的特性。比較持留菌株與抗藥菌株的生長優(yōu)勢(shì)，可引發(fā)對(duì)抗藥性回復(fù)問題的重新思考。本文研究結(jié)果表明當(dāng)去除抗菌藥物壓力后，抗菌藥物壓力下存活的持留菌株比抗藥菌株具有更強(qiáng)的生長優(yōu)勢(shì)，這一結(jié)論尚未見其它類似文獻(xiàn)。雖然持留菌的作用尚未經(jīng)過全面驗(yàn)證，但面對(duì)生態(tài)中嚴(yán)峻的抗藥性問題，持留菌的存在和特性還是提供了一線希望。在環(huán)境中抗菌藥物壓力不斷增大的過程中，存留了一批批“沉睡”的“種子”——持留菌。當(dāng)藥物壓力逐漸降低，人們對(duì)于抗藥性水平降低的期待不僅停留在抗藥菌株的敏感性恢復(fù)[10]，也在于預(yù)留的持留菌“蘇醒”并恢復(fù)活力，以更為原始的菌株特性與現(xiàn)存的抗藥性細(xì)菌共同競爭，而多數(shù)抗藥性細(xì)菌可能由于其抗性代償而處于劣勢(shì)。只有環(huán)境中菌群的抗藥性水平整體回落才能根本解決抗藥性問題，并非對(duì)抗藥菌斬盡殺絕，也非阻斷所有抗藥性機(jī)制。本研究結(jié)論表明，持留菌的存在和形成機(jī)制保留了原始菌株的生長優(yōu)勢(shì)，隨著抗菌藥物使用水平的降低，可能在抗藥性的逆轉(zhuǎn)中起到一定作用。
原始菌株、持留菌及抗藥菌株藥敏特性和生長優(yōu)勢(shì)比較（一）
原始菌株、持留菌及抗藥菌株藥敏特性和生長優(yōu)勢(shì)比較（二）
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