近日，浙江大學生命科學研究院蔣超課題組聯(lián)合北京大學第三醫(yī)院冷玉鑫課題組和中南大學湘雅二醫(yī)院羅紅課題組，在Nature Communications雜志在線發(fā)表題為"Deep longitudinal lower respiratory tract microbiome profiling reveals genome-resolved functional and evolutionary dynamics in critical illness"的研究論文。該研究利用新型開發(fā)的低生物量微生物富集方法（Chelex100-based low-biomass microbial-enrichment method，CMEM），在基因組水平首次系統(tǒng)揭示了重癥監(jiān)護病房（ICU）患者下呼吸道微生物組的功能和進化動態(tài)，為重癥感染的精準診斷和個性化治療提供了新思路。
摘要
下呼吸道感染（LRTIs）是全球性的主要健康問題，2019年已致約300萬人死亡。在重癥監(jiān)護室（ICU）中，患者感染醫(yī)院獲得性下呼吸道感染的風險和病死率均顯著增加。研究顯示，健康人與患者的下呼吸道微生物群落存在顯著差異，提示微生物組在免疫穩(wěn)態(tài)中的關鍵作用，且可能是新的治療目標。然而，目前對其認識十分有限。在進行相關研究時，實驗過程中面臨諸多的挑戰(zhàn)，例如高豐度的宿主DNA污染問題、微生物生物量相對較低的情況，以及連續(xù)收集下呼吸道樣本所面臨的困難。
為此，研究團隊開發(fā)了一種基于Chelex-100的微生物富集方法（CMEM），有效去除宿主DNA并提高微生物DNA產出，使得能直接從臨床下呼吸道樣本構建微生物基因組，進行全基因組水平的系統(tǒng)分析。通過CMEM技術，研究團隊處理了來自中國三家醫(yī)院的157名ICU患者的453個下呼吸道樣本，重構了120個高質量的宏基因組及其質粒序列。該研究揭示了肺炎患者下呼吸道微生物群落的物種級別特征和抗性基因，并發(fā)現了是否確診肺炎、ICU住院時間與特定抗性基因豐度的增加相關。此外，研究團隊還觀察到機會致病菌的抗性和毒力基因組的菌株特異性，以及質粒的保守進化。綜上，該研究結果不僅提供了醫(yī)院內菌株傳播的新視角，還展示了CMEM方法在ICU患者下呼吸道微生物監(jiān)測和研究中的應用潛力。
關鍵點
CMEM方法的開發(fā)：結合基于皂苷的宿主DNA去除技術以及Chelex 100的應用，實現重癥病房患者下呼吸道微生物組的深度測序和菌株水平分析。
重癥監(jiān)護病房特異性微生物特征：揭示了不同ICU內患者特有的微生物組成，以及不同醫(yī)院的ICU之間在主要機會致病菌和抗生素抗性基因上的顯著差異。
臨床數據整合分析：結合臨床數據揭示了不同的下呼吸道微生物組的動態(tài)變化模式可能與患者更嚴重的肺功能障礙和更強的炎癥反應密切相關。
菌株水平全景分析：基于菌株水平的分析描繪了重癥監(jiān)護病房患者下呼吸道微生物群落的基因組功能、傳播及進化特征的全景圖。
引言
下呼吸道感染是全球公共衛(wèi)生領域面臨的主要挑戰(zhàn)之一。2019年，因下呼吸道感染導致的死亡人數高達300萬，使其成為全球致死率最高的傳染病。ICU患者罹患醫(yī)院獲得性下呼吸道感染的風險比普通人群高出3到10倍，并且與之相關的病死率顯著升高。研究表明，ICU患者的下呼吸道微生物群落與健康個體存在顯著差異，提示下呼吸道微生物組在維持機體免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，并有望成為新的治療靶點。然而，目前對ICU患者下呼吸道微生物組的理解仍然有限，關于其縱向動態(tài)變化、與宿主相互作用以及病原菌在臨床環(huán)境中進化適應的研究十分有限。
實驗方法上面臨諸多挑戰(zhàn)，包括口腔共生菌和宿主DNA污染、微生物生物量低，以及縱向樣本采集困難等問題。大多數研究采用16S rRNA等擴增子測序技術，但這種方法存在明顯的PCR偏好性、難以實現全面物種鑒定及功能和進化分析等方面的局限。此外，由于痰液易受口腔菌群污染而支氣管肺泡灌洗液（BALF）取樣具有創(chuàng)傷性，使得獲取連續(xù)時間點的高質量樣本變得十分困難。
傳統(tǒng)上，人們主要依賴微生物培養(yǎng)的方法來診斷下呼吸道微生物、獲取全基因組信息及進行功能表征。但是，微生物培養(yǎng)方法不僅需要了解特定菌種的生長條件，而且工作量大，因此能夠被深入研究的菌種數量非常有限。相比之下，宏基因組學方法能夠在測序深度足夠的情況下生成近似不同物種基因組信息的高質量宏基因組裝基因組（MAGs），從而克服了上述限制。盡管如此，基于MAGs開展的下呼吸道微生物研究仍相對匱乏。
研究團隊應用CMEM方法處理了來自中國三家醫(yī)院的157名重癥監(jiān)護病房患者的453個縱向下呼吸道抽出物樣本。通過高通量測序和后續(xù)的宏基因組組裝，我們無需傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術，便成功重構了120個高質量的宏基因組組裝基因組及其相關的質粒序列。借助對下呼吸道樣本進行深度測序的數據，研究團隊成功地對ICU患者下呼吸道中的微生物群落進行了全面的物種級別分析。該研究在肺炎患者群體中揭示了顯著的醫(yī)院特異性機會致病菌物種特征和抗性基因特征；通過縱向動態(tài)采樣，進一步觀察到肺炎患者下呼吸道內機會致病菌物種特征隨時間發(fā)生分化的現象。經過深入探究，研究團隊發(fā)現是否確診肺炎以及患者在重癥監(jiān)護病房的停留時長，均與某些特定的抗生素耐藥基因的豐度具有顯著的相關性。
研究團隊基于MAGs的分析揭示了機會致病菌中不同菌株之間存在菌株特異性的抗性基因組和毒力基因組；并通過進化分析觀察到，在廣泛流行的機會致病菌中，可移動基因元件的數量顯著增加，同時部分質粒在數十年的進化過程中顯示出高度的保守性。此外，研究團隊還成功鑒定了鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌中的新型重組熱點區(qū)域，并發(fā)現位于這些重組熱點區(qū)域的基因功能與接合元件（conjugative elements）和前噬菌（prophages）有密切關聯(lián)。最終，結合流行病學數據和微生物培養(yǎng)數據的綜合分析，研究團隊揭示了重癥監(jiān)護室內患者間菌株傳播現象的頻繁發(fā)生，為深入理解和闡釋醫(yī)院內病原菌感染的傳播機制提供了新的視角。
結果
CMEM的開發(fā)及其在下呼吸道微生物組深度測序中的應用
研究團隊開發(fā)了一種名為CMEM的方法，該方法能夠顯著提高去除宿主DNA后的微生物DNA產量（圖1a）。這一改進極大地提升了可檢測到的微生物DNA產率。簡而言之，該研究采用了一種改良的皂苷基差分裂解法來去除人源DNA，并通過降低皂苷濃度優(yōu)化了此過程以減少對微生物群落可能造成的損失。為應對下呼吸道樣本中低微生物生物量帶來的挑戰(zhàn)，研究團隊在處理過程中加入了超聲破碎步驟以促進微生物細胞裂解。隨后，利用常用于法醫(yī)調查中的Chelex 100提取極少量的微生物DNA，最終得到適用于深度宏基因組測序的高質量DNA（圖1a）。與Qiagen Power Water及Qiagen Allprep DNA/RNA試劑盒進行的直接對比顯示，CMEM產生的最終DNA產量明顯更高，并且顯著增加了可檢測到的DNA回收率。由于CMEM在DNA產出方面的高效率，對于下呼吸道樣本構建測序文庫時平均僅需5輪擴增循環(huán)，這大大減少了先前研究中處理低生物量樣本時PCR擴增引入的偏差。此外，整個CMEM流程在一個單管內完成，簡化操作的同時也最大限度地減少了DNA損失以及轉移過程中潛在污染的風險。
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